脱细胞猪真皮水凝胶增强植入物在照射条件下的伤口愈合

Decellularized porcine dermal hydrogel enhances implant-based wound healing in the setting of irradiation.

作者信息Lillian DeCostanza, Graham M Grogan, Anthony C Bruce, Corrina M Peachey, Evan A Clark, Kristen Atkins, Tina Tylek, Michael D Solga, Kara L Spiller, Shayn M Peirce, Christopher A Campbell, Patrick S Cottler
PMID39522628
发布时间2025-01-01
DOI10.1016/j.actbio.2024.11.009

实验完整度

研究包含体内动物模型(健康和照射小鼠)、组织学和免疫组化分析、流式细胞术及多维聚类分析等多个独立证据层级,并进行功能验证(纤维化、脂肪生成)和机制验证(巨噬细胞表型)。

主要模型

小鼠皮下植入模型(C57BL/6) 照射小鼠模型(35 Gy) 脱细胞猪真皮水凝胶 脱细胞真皮基质(ADM)

重点核对

C57BL/6小鼠,雌性,40只(0 Gy)和40只(35 Gy) 放射剂量:单次35 Gy,使用SARRP225照射器 植入时间:放射后12周 ADM样本:DermACELL,5 mm打孔活检 DPD水凝胶注射量:0.5 mL

摘要

脱细胞真皮基质(ADM)在植入物乳房重建中提供机械和软组织支持,并已显示可调节愈合反应。然而,皮瓣坏死、水肿和既往放疗可阻碍ADM整合。有效的生物材料整合需要调节免疫反应、纤维化和脂肪细胞驱动的功能化。细胞外基质(ECM)水凝胶已被证明在组织再生以及减少各种组织的炎症和纤维化方面具有效用。因此,我们假设脱细胞猪真皮(DPD)水凝胶支持ADM整合可防止过度纤维化,调节巨噬细胞反应,并促进脂肪生成。在ADM植入小鼠(健康和放射)期间探索DPD水凝胶揭示了照射对植入物伤口愈合的长期影响。DPD水凝胶挽救了放射诱导的纤维化,恢复了健康小鼠的包膜厚度,并且没有增加成纤维细胞向ADM的迁移。作为一种调节性软组织填充剂,DPD水凝胶还促进了健康和照射小鼠的脂肪细胞浸润。详细的巨噬细胞分析表明,放射导致促炎、过渡和修复标志物增加。尽管对单个巨噬细胞表型标志物的影响相对微妙,但多维流式细胞术分析显示,DPD水凝胶在时间上调节了两个亚群。DPD的存在导致健康小鼠在1周时CD9HiArg1HiCD301bLo和CD163HiCD38HiCD301bHi巨噬细胞显著减少,而在照射小鼠中6周时CD9High且其他标志物低表达的巨噬细胞显著增加。DPD水凝胶在健康和照射伤口床中促进减少纤维化和脂肪细胞促进的伤口愈合协调,同时不破坏ADM的免疫调节作用。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
脱细胞猪真皮(DPD)水凝胶能否调节健康和照射环境下的伤口愈合,减少纤维化、调节巨噬细胞反应并促进脂肪生成,从而改善ADM的整合?
核心机制
DPD水凝胶通过调节巨噬细胞亚群(如CD9Hi亚群)和减少纤维化,同时促进脂肪生成,协调伤口愈合过程。
主要证据
在小鼠模型中,DPD水凝胶降低了照射诱导的包膜厚度,减少了早期间充质细胞浸润,促进了脂肪细胞浸润,并通过多维流式细胞术鉴定了DPD水凝胶对特定巨噬细胞亚群的调控。
研究意义
DPD水凝胶作为ADM的辅助生物活性材料,在植入物乳房重建中具有促进脂肪浸润、改善临床结局的潜力。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

制备DPD水凝胶

制备用于体内植入的脱细胞猪真皮来源的水凝胶。

猪真皮脱细胞处理,冻干,研磨,胃蛋白酶消化,中和,形成水凝胶。

2

小鼠皮肤放射处理

模拟放疗对皮肤的影响,建立延迟重建模型。

对小鼠背部皮肤给予单次35 Gy照射,12周后植入材料。

3

ADM植入和DPD水凝胶注射

评估DPD水凝胶对ADM整合的影响。

在皮下口袋植入ADM,并在右侧注射DPD水凝胶。

4

组织学和免疫组化分析

评估纤维化、细胞浸润和脂肪生成。

固定、包埋、切片,进行H&E染色和vimentin、αSMA免疫组化,量化包膜厚度、vimentin面积和脂肪细胞密度。

5

流式细胞术分析

评估巨噬细胞反应和表型。

收获植入物及周围组织,消化,染色,进行流式细胞术分析。

6

多维聚类分析

识别DPD水凝胶对巨噬细胞亚群的影响。

对流式数据使用Phenograph和FlowSOM聚类,比较健康小鼠1周和照射小鼠6周的亚群变化。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
胰蛋白酶----
Triton X-100----
胃蛋白酶----
微型切割磨机Thermo Fisher Scientificmodel #1171H10
Plurogel®Medline Industries--
DermACELLLifeNet Health--
Ethiqa XR----
抗波形蛋白抗体Abcamab45939
抗α平滑肌肌动蛋白抗体Abcamab32575
RPMI 1640培养基Thermo FisherA1049101
胶原酶D----
脱氧核糖核酸酶----
AQUA LIVE/DEAD固定死细胞染色试剂盒Invitrogen--
TruStain FcXBiolegend--
抗CX3CR1抗体Biolegend149031
抗CD192抗体Biolegend150630
抗CD184抗体Thermo Fisher63-9991-80
抗F4/80抗体Biolegend123129
抗CD9抗体Miltenyi Biotec130-123-064
抗CD38抗体Biolegend102717
抗CD86抗体ElabscienceE-AB-F0994UI
抗CD163抗体Thermo Fisher11-1631-82
抗CD301b抗体Biolegend146805
IC固定缓冲液Invitrogen50-112-9037
透化缓冲液Invitrogen50-112-9037
抗精氨酸酶-1抗体Thermo Fisher46-3697-80
Cytek Aurora流式细胞仪Cytek Biosciences--
Axioscan 7扫描仪Zeiss--
Leica DM6显微镜Leica Microsystems--
ImageJ--2.14

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
DPD水凝胶制备
脱细胞步骤的详细时间、试剂浓度(如胰蛋白酶、Triton X-100、过氧乙酸)、消化浓度(15 mg/mL)、胃蛋白酶浓度(1.25 mg/mL)、中和pH(8.8)
阅读提示:见Methods 2.1 脱细胞猪真皮水凝胶的制备
小鼠放射处理
小鼠品系(C57BL/6)、性别(雌性)、年龄/体重(20.9 ± 2.0 g)、放射剂量(35 Gy)、照射器参数(SARRP225)、放射后植入等待时间(12周)
阅读提示:见Methods 2.2 小鼠皮肤放射处理
ADM植入和DPD水凝胶注射
ADM型号(DermACELL)、尺寸(5 mm直径)、DPD水凝胶注射量(0.5 mL)、麻醉(2%异氟醚)、缝合方式(4-0 Vicryl)、镇痛(Ethiqa XR 3.25 mg/kg)
阅读提示:见Methods 2.3 ADM和DPD水凝胶植入
组织学和免疫组化
固定液(10%缓冲福尔马林)、切片厚度(5微米)、抗vimentin抗体浓度(1:200)、抗αSMA浓度(1:400)、图像分析软件(ImageJ 2.14)
阅读提示:见Methods 2.4 组织学和免疫组化
流式细胞术
消化酶浓度(胶原酶D 2 mg/mL, DNase 1 mg/mL)、细胞计数(每样本1.5百万)、抗体克隆号及稀释度(见方法)、流式细胞仪(Cytek Aurora)
阅读提示:见Methods 2.5 流式细胞术