ATAC-seq分析染色质可及性差异
鉴定HCC与正常组织间差异可及的染色质区域（DARs）及其相关信号通路和转录因子。
对4对HCC肿瘤和癌旁正常组织进行ATAC-seq测序，使用MAnorm2算法识别DARs，并进行KEGG通路富集和转录因子基序分析。
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基于ATAC-seq和RNA-seq的综合分析揭示肝细胞癌中的新型癌基因PRPF3
Integrative analysis based on ATAC-seq and RNA-seq reveals a novel oncogene PRPF3 in hepatocellular carcinoma.
实验完整度
高包含ATAC-seq和RNA-seq多组学分析、体外细胞功能实验（增殖、迁移、侵袭）、体内小鼠移植瘤实验及ChIP-seq验证，功能与机制验证完整。
主要模型
HCC细胞系（MHCC-97h、Huh7、HepG2、Jhh-7） 正常肝细胞系L02 BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型 HCC患者肿瘤及癌旁组织样本
重点核对
ATAC-seq使用4对HCC肿瘤及癌旁组织样本 siRNA敲低PRPF3和ZNF93（siPRPF3-1/2, siZNF93-1/2） PRPF3和ZNF93过表达慢病毒感染HCC细胞 细胞增殖、迁移和侵袭检测（CCK-8、EdU、Transwell、划痕实验） 体内实验：4周龄雌性BALB/c裸鼠，每组4只，皮下注射6×10^6个细胞
摘要
背景：转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）是一种高通量测序技术，可检测基因组中的开放染色质区域。这些区域对于促进转录因子结合及随后的基因表达至关重要。在此，我们利用ATAC-seq来识别调控肝细胞癌（HCC）发生发展的关键分子靶点，并阐明其潜在机制。方法：我们首先比较了HCC与正常组织之间的染色质可及性谱。随后，利用RNA-seq数据来鉴定差异表达基因（DEGs）。整合ATAC-seq和RNA-seq数据，能够识别与差异可及区域（DARs）相关的转录因子及其推定靶基因。最后，进行了功能实验，以研究已识别的调控因子及相应靶基因对HCC细胞增殖和迁移的影响。结果：对HCC与癌旁正常组织之间DARs的富集分析揭示了不同的信号通路和调控因子。HCC中上调的DARs富集于与MAPK和FoxO信号通路相关的基因，并与ETS和AP-1等转录因子家族相关。相反，下调的DARs与TGF-β、cAMP和p53信号通路及CTCF家族相关。数据集的整合揭示了特定DARs与DEGs之间的正相关。值得注意的是，PRPF3成为HCC中与DARs相关的基因，功能实验证明其能够促进HCC细胞增殖和迁移。据我们所知，这是首次报道PRPF3在HCC中的致癌作用。此外，ZNF93的表达与PRPF3呈正相关，ChIP-seq数据表明其可能作为转录因子通过结合PRPF3启动子区域来调控PRPF3。结论：本研究对HCC的表观遗传景观进行了全面分析，涵盖染色质可及性和转录组。我们的发现揭示，ZNF93通过转录调控新型癌基因PRPF3，促进HCC细胞的增殖和运动能力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肝细胞癌中调控肿瘤发生发展的关键分子靶点及其表观遗传调控机制是什么？
- 核心机制
- ZNF93作为转录因子通过结合PRPF3启动子区域，转录上调PRPF3表达，从而促进HCC细胞增殖和迁移。
- 主要证据
- ATAC-seq和RNA-seq整合分析鉴定PRPF3为DARs相关基因；体外敲低和过表达实验证实PRPF3和ZNF93调控HCC细胞增殖、迁移和侵袭；体内移植瘤实验证实其促肿瘤作用；ChIP-seq数据和表达相关性支持ZNF93调控PRPF3；挽救实验证明PRPF3是ZNF93功能效应器。
- 研究意义
- 本研究首次揭示PRPF3在HCC中的致癌作用，并阐明ZNF93-PRPF3调控轴，为HCC靶向治疗提供新视角和潜在分子靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
整合TCGA RNA-seq数据鉴定DEGs
识别HCC中差异表达基因（DEGs），并与DARs关联。
从TCGA获取LIHC RNA-seq数据（371肿瘤，50正常），使用edgeR筛选DEGs（|log2FC|>1, p<0.05），并与DARs进行相关性分析。
PRPF3表达和预后分析
验证PRPF3在HCC中的表达水平及其与预后的关系。
通过TCGA数据、qRT-PCR、Western blot和免疫组化染色检测PRPF3表达，并利用K-M曲线分析预后。
体外功能实验验证PRPF3功能
验证PRPF3对HCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
在MHCC-97h和Huh7细胞中敲低或过表达PRPF3，通过CCK-8、集落形成、EdU、Transwell和划痕实验检测细胞功能。
体内移植瘤实验
验证PRPF3过表达对肿瘤生长的影响。
将稳定过表达PRPF3的Huh7细胞皮下注射到裸鼠，比较肿瘤体积和重量。
鉴定上游转录因子ZNF93
预测并验证调控PRPF3的上游转录因子。
使用MEME FIMO扫描DARs中的转录因子结合位点，筛选结合于PRPF3启动子区域的候选因子，并通过ChIP-seq数据和表达相关性验证ZNF93。
ZNF93功能实验
验证ZNF93对HCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
在MHCC-97h和Huh7细胞中敲低或过表达ZNF93，进行CCK-8、集落形成、EdU、Transwell和划痕实验，并评估体内肿瘤生长。
挽救实验验证ZNF93-PRPF3轴
验证PRPF3是否介导ZNF93的促癌作用。
在ZNF93过表达的Huh7细胞中敲低PRPF3，检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| ATAC-seq测序 | FASTX | -- | -- |
| Bowtie2 | -- | -- | |
| SAMtools | -- | -- | |
| ATAC-seq数据比对 | MACS2 | -- | -- |
| 差异可及性分析 | MAnorm2 | -- | -- |
| 基因注释 | ChIPseeker | -- | -- |
| 通路富集分析 | ClusterProfiler | -- | -- |
| 基序发现 | HOMER | -- | -- |
| RNA-seq差异表达分析 | edgeR | -- | -- |
| 生存分析 | survival R包 | -- | -- |
| survminer | -- | -- | |
| 转录因子结合位点扫描 | MEME FIMO | -- | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 基因敲低转染 | 小干扰RNA | Genepharma | -- |
| 基因过表达转染 | 慢病毒 | OBIO | -- |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Vazyme Biotech | -- |
| ExScript RT-PCR试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| SYBR Green预混液 | Vazyme Biotech | -- | |
| EdU增殖检测 | EdU检测试剂盒 | Elabscience | #E-CK-A376 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白分离 | SDS-PAGE凝胶电泳 | -- | -- |
| 蛋白转移 | PVDF膜 | -- | -- |
| 蛋白检测 | 化学发光检测法 | -- | -- |
| 图像定量 | ImageJ软件 | -- | -- |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂 | -- | -- |
| 细胞侵袭实验 | 基质胶 | -- | -- |
| 显微镜观察 | 倒置显微镜 | -- | -- |
| 统计绘图 | GraphPad Prism 8.0 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 肿瘤和癌旁组织样本数量（4对），距离肿瘤边缘>1cm，患者性别、年龄、病理类型 阅读提示：Methods - Samples, Table 1 |
| ATAC-seq | 测序平台（上海博奥生物技术公司），比对参数（Bowtie2，映射质量≥30），峰识别（MACS2），差异分析（MAnorm2，M值阈值>0.5或<-0.5） 阅读提示：Methods - ATAC-seq data processing and analysis |
| RNA-seq分析 | TCGA LIHC数据（371肿瘤，50正常），差异表达阈值（|log2FC|>1, p<0.05） 阅读提示：Methods - RNA-seq data processing |
| 细胞培养和转染 | 细胞系（MHCC-97h, Huh7, HepG2, Jhh-7, L02），培养基（DMEM+10%FBS），siRNA序列（siPRPF3-1/2, siZNF93-1/2, siNC），慢病毒构建（OBIO） 阅读提示：Methods - Cell lines and transfection, Table S1/S2 |
| qRT-PCR和Western blot | 内参基因（β-actin），RNA提取试剂（TRIzol），逆转录试剂盒（ExScript RT-PCR kit），SYBR Green Master Mix，抗体信息 阅读提示：Methods - Quantitative RT-PCR and Western blotting, Table S3/S4 |
| 细胞增殖和迁移实验 | CCK-8（3000细胞/孔，孵育2h），集落形成（1000细胞/孔，14天），EdU检测，Transwell（4×10^4细胞，24h），划痕实验（观察0,24,48h） 阅读提示：Methods - Cell proliferation, colony formation, and EdU incorporation assays; Cell migration and scratch assay |
| 体内实验 | 裸鼠品系（BALB/c，雌性，4周龄），每组数量（n=4），注射细胞数（6×10^6），测量时间（第14天），肿瘤体积公式 阅读提示：Methods - In vivo proliferation assay in mice |
| 转录因子预测 | MEME FIMO扫描参数，启动子区域（TSS上游2kb至下游100bp），筛选标准（结合位点位于启动子区域） 阅读提示：Methods - Identification of upstream transcription factors (TFs) |