抗菌模式评估
评估不同浓度磷霉素对产KPC肺炎克雷伯菌的抗菌活性。
采用时间-杀菌试验，检测不同浓度（0.25*MIC至32*MIC）的FM对ATCC BAA-1705和ATCC BAA-1706的杀菌效果，在0、1、2、4、6小时取样涂板计数。
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磷霉素与多黏菌素联合抗产KPC肺炎克雷伯菌的协同作用：药代动力学-药效学结合转录组学方法
Synergistic effect of fosfomycin and colistin against KPC-producing Klebsiella pneumoniae: pharmacokinetics-pharmacodynamics combined with transcriptomic approach.
实验完整度
高包含体外杀菌试验、突变筛选、氧化应激检测、细胞感染模型及转录组分析等多个独立证据层级，具有明确机制验证。
主要模型
产KPC肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705 产KPC肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706 临床分离株17186 THP-1巨噬细胞感染模型
重点核对
菌株：ATCC BAA-1705，ATCC BAA-1706，临床分离株17186 药物浓度：FM（83 mg/L），COL（4 mg/L），FM+COL（83 mg/L+4 mg/L） 处理时间：转录组分析时药物处理8小时 突变筛选浓度：FM（8、32、64、83 mg/L），COL（4 mg/L），FM+COL（83+4 mg/L） ROS检测：使用10 μM DCFH-DA探针孵育25分钟
摘要
目的：本研究旨在确定磷霉素（FM）与多黏菌素（COL）联合抗产KPC肺炎克雷伯菌（KPC-Kp）的协同作用及其机制。方法：通过时间-杀菌试验和突变率试验评价FM联合COL的杀菌效果、诱导耐药性和细胞毒性。采用时间-杀菌试验和转录组学分析进一步阐明FM联合COL的作用机制。在不同时间点取细菌，检测活性氧（ROS）、一氧化氮和氧化还原相关酶。通过转录组分析协同杀菌作用机制。结果：FM联合COL的杀菌效果优于单药。低剂量（8 mg/L)FM单独使用的突变频率高于高剂量（64 mg/L）。COL诱导的耐药菌株导致FM和COL耐药，而FM单独或与COL联合仅导致FM耐药。FM联合COL抗K. pneumoniae的Thp-1细胞存活率高于单药。随着FM浓度增加，KPC-Kp胞内一氧化氮、总超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性增加。FM联合COL诱导ROS积累和抗氧化能力增加。转录组分析显示FM联合COL可调节soxRS和氧化磷酸化水平，清除ROS并修复损伤。此外，FM联合COL通过抑制核糖体转录产生协同杀菌作用。结论：FM联合COL通过调节ROS积累和抑制核糖体蛋白转录介导协同杀菌作用，产生较低的耐药性和细胞毒性。补充信息：在线版本包含补充材料，可在10.1186/s12866-024-03581-1获取。关键词：磷霉素，多黏菌素，PK/PD，协同作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 磷霉素联合多黏菌素对产KPC肺炎克雷伯菌是否具有协同作用及其机制是什么？
- 核心机制
- 联合用药通过诱导ROS积累和抑制核糖体蛋白转录，同时调节soxRS和氧化磷酸化水平，从而降低耐药性和细胞毒性，产生协同杀菌作用。
- 主要证据
- 时间-杀菌试验显示联合用药优于单药；突变筛选显示联合用药耐药率低；转录组分析显示联合用药下调核糖体生物合成相关基因（如rplT、rpsT等）表达，并上调soxRS、下调氧化磷酸化。
- 研究意义
- 该研究为优化磷霉素和多黏菌素联合治疗产KPC肺炎克雷伯菌感染提供了机制依据，支持联合用药以降低耐药性风险。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
氧化应激相关检测
探究磷霉素单用及联合多黏菌素对细菌氧化应激的影响。
将菌株分别用FM（8、32、64、83 mg/L）、COL（4 mg/L）和FM+COL（83+4 mg/L）处理不同时间，测定总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和NO水平；处理12小时后检测ROS水平。
细胞感染模型杀菌试验
评估磷霉素联合多黏菌素在THP-1巨噬细胞感染模型中的杀菌效果。
建立THP-1细胞感染模型，以不同感染复数（100:1, 10:1, 1:1）加入药物处理，在不同时间点收集上清和胞内细菌进行计数。
耐药突变筛选
评估不同药物处理诱导细菌耐药突变的情况。
将菌株接种至含不同药物浓度的MHA平板，培养24, 48, 72小时，计数突变菌落并计算突变率；随后连续传代30代获得稳定突变株，测定FM和COL的MIC。
转录组测序分析
分析磷霉素联合多黏菌素对基因表达的影响，揭示协同机制。
用FM（83 mg/L）、COL（4 mg/L）和FM+COL（83+4 mg/L）处理菌株8小时，提取RNA进行转录组测序，比较差异表达基因，并进行GO富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗菌活性测定 | 穆勒-辛顿肉汤 | -- | -- |
| 氧化应激检测 | 总抗氧化能力检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 总超氧化物歧化酶活性检测试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | -- | |
| 过氧化氢酶活性检测试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | -- | |
| 一氧化氮检测 | 一氧化氮比色检测试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | -- |
| ROS检测 | DCFH-DA | -- | -- |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞感染模型 | 佛波酯 | -- | -- |
| 基因组测序 | QIAamp DNA小提试剂盒 | Qiagen | -- |
| 测序 | HiSeq 2000 | Illumina | -- |
| 药物处理 | 磷霉素 | Dalian Meilun Biotech | -- |
| 多黏菌素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 药物辅助 | 6-磷酸葡萄糖 | Sigma-Aldrich | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抗菌活性测定 | 培养基成分（MHB含25 mg/L G6P）、药物浓度梯度、取样时间点 阅读提示：Methods: Antibacterial pattern of FM against K. pneumoniae |
| 氧化应激检测 | 药物浓度、处理时间点、检测试剂盒 阅读提示：Methods: Oxidative stress related assays |
| 细胞感染模型 | THP-1细胞培养条件、感染复数、药物浓度、取样时间 阅读提示：Methods: The effect of FM combined with COL against THP-1 infected with KPN |
| 耐药突变筛选 | 选择平板上的药物浓度、培养时间、传代次数 阅读提示：Methods: Mutant screens |
| 转录组测序 | 处理浓度、处理时间、生物学重复数 阅读提示：Methods: Transcriptome sequencing and comparative transcriptome analysis |