褪黑素提高超氧化物歧化酶2(SOD2)水平并改善大鼠卵巢移植后的移植物功能。

Melatonin increases superoxide dismutase 2 (SOD2) levels and improves rat ovarian graft function after transplantation.

作者信息Karla Krislane Alves Costa Monteiro, Luciana Lamarão Damous, Marcos Eiji Shiroma, Lara Termini, José Cipolla-Neto, Ricardo Dos Santos Simões, Rinaldo Florencio da Silva, José Antonio Turri, Edmund C Baracat, Jose Maria Soares-Junior
PMID39415169
发布时间2024-10-16
DOI10.1186/s13048-024-01512-2

实验完整度

包含动物模型、生化分析、组织形态计量学和免疫组化,但缺乏体外或机制验证。

主要模型

3月龄雌性Wistar大鼠卵巢移植模型 冷冻保存的卵巢组织

重点核对

大鼠品系:Wistar;年龄:3月龄;体重:约250g 分组:对照组(CG)和褪黑素组(MG),每组初始12只,最终各10只 褪黑素浓度:0.1 μm,在乙醇载体中稀释 冷冻保存时间:在液氮中24小时 移植后观察时间:30天(在动情间期处死)

摘要

背景:卵巢冷冻保存是一种有前途的技术,尽管受到冷冻和解冻损伤的阻碍。褪黑素可以减轻这种结果。目的:本研究旨在评估褪黑素在冷冻保存的细胞培养中对卵巢组织卵泡动力学的影响。方法:3月龄成年雌性Wistar大鼠(n = 24)体重约250g,切除卵巢并分为两组(n = 12):对照组(CG)和褪黑素组(MG)。在CG中,按照标准方案使用M2培养基和二甲基亚砜(DMSO)进行慢速冷冻保存。在MG中,将褪黑素以0.1 μm的浓度稀释在乙醇载体中添加到培养基中。在两组中,卵巢通过慢速冷冻保存并保存在液氮中24小时。随后,在解冻后,将卵巢重新植入腹膜后,大血管(下腔静脉和主动脉)两侧各一个。30天后,在动情间期处死动物;然后取出移植物并进行组织形态计量学和免疫组织化学分析,而血液则进行生化分析。采用Student t检验评估两组之间的差异。结果:MG组的FSH水平(83.79 ± 32.37)低于CG组(120.52 ± 36.59),p = 0.03。MG组的FSH/AMH比值(3.53 ± 1.13)也低于CG组(6.52 ± 2.85),p = 0.001。除了退化卵泡(卵泡细胞和内膜细胞)外,MG组的SOD2免疫表达在所有参数上均高于CG组:CG(16.80 ± 4.80 [13.36–20.24])和MG(14.91 ± 4.04 [12.01–17.79])p = 0.351。在完整卵泡(膜细胞+间质)方面,CG(6.60 ± 2.59 [4.75–8.45])和MG(9.31 ± 3.09 [7.09–11.51])之间的差异具有统计学意义(p = 0.049),而正常窦卵泡的表达差异较小。结论:褪黑素可以改善冷冻保存组织的质量,如本研究所示,并且评估冷冻保存的卵巢移植物,如褪黑素组显示更好的激素参数和更高的SOD2抗氧化剂免疫组织化学表达。因此,在冷冻保存和移植过程中损伤减少。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
褪黑素是否能通过影响SOD2酶和卵巢功能,改善冷冻保存的大鼠卵巢组织移植后的卵巢功能。
核心机制
褪黑素通过增加SOD2表达,发挥抗氧化作用,减少冷冻保存和移植过程中的氧化应激损伤,从而改善卵巢功能。
主要证据
在大鼠卵巢移植模型中,褪黑素组FSH水平降低、FSH/AMH比值降低,SOD2免疫组化表达增加,完整卵泡数量增加,退化卵泡减少。
研究意义
褪黑素可能改善冷冻保存卵巢移植物的质量,为生育力保存提供潜在应用价值。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

动物分组与卵巢切除

建立卵巢移植模型,并进行对照和褪黑素处理组的分组。

24只3月龄Wistar大鼠随机分为两组(CG和MG),进行双侧卵巢切除。

2

慢速冷冻保存与褪黑素处理

比较标准冷冻方案与添加褪黑素的方案对卵巢组织的影响。

CG使用M2培养基和DMSO按标准方案冷冻;MG在培养基中添加0.1 μm褪黑素(乙醇载体)后冷冻。两组卵巢均在液氮中保存24小时。

3

卵巢移植与术后观察

评估移植后卵巢组织的存活和功能恢复。

解冻后,将卵巢原位移植到腹膜后(大血管两侧)。术后监测动情周期,30天后在动情间期处死动物。

4

血液生化与激素分析

评估卵巢功能相关的激素水平。

处死时采集血液,通过放射免疫分析测定FSH、LH、雌二醇、孕酮、AMH和抑制素B水平,并计算LH/FSH和FSH/AMH比值。

5

组织学与免疫组织化学分析

评估卵巢组织形态和SOD2表达。

移植物固定、包埋、切片,进行H&E染色用于组织形态计量学分析(卵泡和黄体计数),免疫组化检测SOD2表达。

6

统计分析与相关性检验

比较组间差异并分析激素与SOD2表达的相关性。

使用Student t检验比较两组差异,Spearman相关检验分析激素与SOD2的关系,并采用logistic回归分析影响因子。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证样本或模型特征
验证分子表达变化

产品清单

实验环节名称品牌货号
M2培养基----
褪黑素SigmaAldrich--
SOD2抗体Abcamab13533
UltraView通用DAB检测试剂盒Ventana Medical Systems, Inc., Roche--
Ventana BenchMark GX设备Roche Diagnostics--
FSH ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-R0391
LH ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-R0026
雌二醇ELISA试剂盒ElabscienceE-OSEL-R0001
孕酮ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-0154
AMH ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-R3022
抑制素B ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-R1027
FSH ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-R0391

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物分组与手术
大鼠品系、年龄、体重、分组数量(CG/MG),手术步骤(卵巢切除方法、移植位置)
阅读提示:Materials and methods (Groups; Oophorectomy and ovarian graft implantation procedures)
冷冻保存与褪黑素处理
冷冻方案(慢速冷冻)、保存时间(液氮24小时)、褪黑素浓度(0.1 μm)及溶剂(乙醇载体)
阅读提示:Materials and methods (Groups)
激素测定
激素种类(FSH、LH、雌二醇、孕酮、AMH、抑制素B)、检测试剂盒货号、检测范围、灵敏度、样本处理(离心条件)
阅读提示:Materials and methods (Blood collection and biochemical analysis)
组织学分析
固定液(10%甲醛)、切片厚度(3 μm)、染色方法(H&E)、卵泡计数和分类标准
阅读提示:Materials and methods (Morphological and immunohistochemical analyses)
免疫组化
抗原修复条件、一抗(anti-SOD2, ab13533)浓度(1:1000)及孵育时间(32分钟)、检测试剂盒(UltraView DAB)、设备(BenchMark GX)
阅读提示:Materials and methods (Morphological and immunohistochemical analyses)
统计分析
统计软件(STATA 16 SE)、显著性水平(p < 0.05)、检验方法(Student t test、Spearman、logistic回归)
阅读提示:Materials and methods (Statistical analysis)