Polyinosinic-polycytidylic acid modulates Porphyromonas gingivalis-induced cell apoptosis via the janus kinase/ signal transducer and activator of transcription signaling pathway.
包含体外HUVECs细胞模型、APOE-/-小鼠体内模型、TUNEL凋亡检测、Western blot蛋白表达分析、流式细胞术凋亡定量及STAT抑制剂功能验证。
人脐静脉内皮细胞（HUVECs） APOE-/-小鼠动脉粥样硬化模型
P. gingivalis W83菌株，MOI=100:1感染HUVECs 24小时 Poly (I:C)预处理浓度10 μg/mL，处理24小时 APOE-/-小鼠经尾静脉注射P. gingivalis（10^7 CFU/0.1 mL PBS），每周两次，持续12周 Poly (I:C)腹腔注射剂量5 μg/g体重 STAT1抑制剂Fludarabine浓度100 μM，预处理2小时
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
研究Poly (I:C)对P. gingivalis诱导的体内主动脉根部细胞凋亡的影响。
APOE-/-小鼠喂养高脂饮食，随机分为PBS+PBS、PBS+P. gingivalis、Poly (I:C)+P. gingivalis三组。P. gingivalis经尾静脉注射（10^7 CFU），Poly (I:C)腹腔注射（5 μg/g）。12周后取心脏，对主动脉根部进行TUNEL染色和免疫组化检测Caspase 3、Bax、Bcl-2。
在体外模型中验证Poly (I:C)对P. gingivalis诱导的HUVECs凋亡的抑制作用。
HUVECs培养至80-90%融合，用10 μg/mL Poly (I:C)或PBS预处理24小时，然后以MOI=100:1加入P. gingivalis共培养24小时。通过Western blot检测凋亡相关蛋白（Caspase 3/9、Bax、Bcl-2）表达，通过流式细胞术（Annexin V-FITC/PI双染）检测细胞凋亡。
探索Poly (I:C)抗凋亡作用的潜在机制是否涉及JAK/STAT信号通路。
Western blot检测p-JAK1/2和p-STAT1的表达。使用STAT1抑制剂Fludarabine（100 μM）预处理HUVECs 2小时，再依次加入Poly (I:C)和P. gingivalis，检测p-STAT1及凋亡相关蛋白表达，以验证STAT1在Poly (I:C)抗凋亡中的作用。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 内皮细胞培养基 | ScienCell | -- |
| 胎牛血清 | ScienCell | -- | |
| 内皮细胞生长补充剂 | ScienCell | -- | |
| 细胞刺激 | 聚肌胞苷酸 | Sigma | -- |
| STAT抑制 | 氟达拉滨（STAT1激活抑制剂） | Selleck | -- |
| 对照处理 | 二甲基亚砜 | Solarbio | -- |
| 动物实验 | 高脂饮食（D12109C） | FBSH | -- |
| 凋亡检测 | TUNEL染色试剂盒 | Beyotime | -- |
| 免疫组化 | 抗Caspase 3抗体 | abcepta | -- |
| 抗Bcl-2抗体 | Zenbio | -- | |
| 抗Bax抗体 | Abclonal | -- | |
| 光学显微镜 | Olympus | -- | |
| 流式细胞术 | Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒 | Elabscience Biotechnology | -- |
| Western blot | 抗Caspase 9抗体 | Abclonal | -- |
| 抗磷酸化JAK1抗体 | Zenbio | -- | |
| 抗磷酸化JAK2抗体 | Zenbio | -- | |
| 抗JAK1抗体 | Zenbio | -- | |
| 抗JAK2抗体 | Affinity Bioscience | -- | |
| 抗Bcl-2抗体 | Zenbio | -- | |
| 抗Caspase 3抗体 | abcepta | -- | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | ZSGB-Bio | -- | |
| 抗磷酸化STAT1 (Tyr701)抗体 | Abclonal | -- | |
| 抗磷酸化STAT1 (Tyr701)抗体 | Affinity Bioscience | -- | |
| 抗STAT1抗体 | Affinity Bioscience | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HUVECs培养基、血清浓度、生长补充剂浓度、培养温度和CO2浓度、细胞代数 阅读提示：Methods中的Cell culture部分 |
| 细菌培养 | P. gingivalis菌株、培养条件、离心参数（6000 rpm, 4°C, 10分钟）、PBS洗次数、OD600=0.5对应的浓度（约10^8 CFU/ml） 阅读提示：Methods中的Bacterial culture and challenge部分 |
| 细胞刺激 | Poly (I:C)浓度（10 μg/mL）、预处理时间（24小时）、MOI（100:1）、共培养时间（24小时） 阅读提示：Methods中的Stimulation protocol部分 |
| STAT抑制实验 | Fludarabine浓度（100 μM）、预处理时间（2小时）、DMSO对照 阅读提示：Methods中的Stimulation protocol部分和Figure 4图注 |
| 动物模型 | 小鼠品系（APOE-/-）、性别（雄性）、年龄（8周龄）、数量（18只）、饮食（高脂饮食D12109C）、分组（PBS+PBS、PBS+P. gingivalis、Poly (I:C)+P. gingivalis）、P. gingivalis注射方式（尾静脉，10^7 CFU/0.1 mL PBS，每周两次）、Poly (I:C)注射方式（腹腔，5 μg/g体重，感染前2小时）、实验周期（12周） 阅读提示：Methods中的Animals and diets部分 |
| 凋亡检测 | TUNEL染色试剂盒（Beyotime）及操作步骤 阅读提示：Methods中的TUNEL straining部分 |
| 免疫组化 | 组织处理（脱蜡、水化、封闭时间、一抗孵育条件、二抗孵育、DAB显色）、抗体（Caspase 3, Bcl-2, Bax） 阅读提示：Methods中的Immunohistochemistry (IHC) and imaging部分 |
| 流式细胞术 | Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒、胰酶消化（不含EDTA）、PBS洗涤、孵育时间（室温20分钟） 阅读提示：Methods中的Flow cytometry部分 |
| Western blot | 蛋白提取、电泳、转膜、抗体孵育、显色、内参（β-Tubulin）、定量软件（ImageJ） 阅读提示：Methods中的Western blot analysis部分 |
