中性粒细胞靶向核脱颗粒促进溃疡性结肠炎肺炎进展

Targeted nuclear degranulation of neutrophils promotes the progression of pneumonia in ulcerative colitis.

作者信息Yiming Shao, Qibing Zheng, Xiaobei Zhang, Ping Li, Xingxin Gao, Liming Zhang, Jiahong Xu, Lingchao Meng, Yanyun Tian, Qinqin Zhang, Guangxi Zhou
PMID39540022
发布时间2024-10-14
DOI10.1093/pcmedi/pbae028

实验完整度

包含患者样本、体外细胞实验、DSS小鼠模型及体内迁移验证,并涉及功能验证和机制研究。

主要模型

DSS诱导的结肠炎小鼠模型 小鼠中性粒细胞 人外周血中性粒细胞

重点核对

患者与健康志愿者外周血中性粒细胞比较,每组15例 DSS小鼠造模:2.0% DSS饮水7天 外源中性粒细胞注入肠黏膜并6小时后检测肺部迁移 LPS鼻内给药诱导肺部感染模型 使用PMA和LPS刺激中性粒细胞研究NETs形成

摘要

背景 肠道和肺部系统都是黏膜免疫系统的组成部分,包含约80%的所有免疫细胞。这些免疫细胞在各种黏膜组织之间迁移或转运,以维持组织稳态。 方法 在本研究中,我们从患者外周血中分离中性粒细胞,并利用免疫荧光、流式细胞术和Western blotting确认'核定向脱颗粒'现象在体外的发生。随后,我们使用arivis软件进行了精确分析。此外,利用DSS小鼠结肠炎模型和组织透明化技术,我们验证了中性粒细胞的'靶向核脱颗粒'及其在炎症性肠环境中向肺部的迁移。 结果 在本研究中,我们发现,在溃疡性结肠炎患者中,具有'靶向核脱颗粒'的中性粒细胞从肠黏膜迁移到肺部,在肺部感染期间显著加重肺部炎症。值得注意的是,溃疡性结肠炎患者表现出更高丰度的靶向核脱颗粒中性粒细胞。使用DSS小鼠,我们观察到来自肠黏膜的靶向核脱颗粒中性粒细胞在肺部感染期间迁移到肺部并被激活。这些中性粒细胞迅速释放大量中性粒细胞胞外陷阱,介导肺部炎症的进展。中性粒细胞细胞骨架的改变及其与核膜的相互作用是靶向核脱颗粒的主要机制。 结论 本研究揭示,中性粒细胞加速了结肠炎中肺部炎症的进展,为结肠炎患者的肺部感染提供了新的见解和潜在的治疗靶点。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
溃疡性结肠炎患者肺部感染后症状恶化是否与肠道中性粒细胞的靶向核脱颗粒及其迁移至肺部有关?
核心机制
在溃疡性结肠炎中,肠道中性粒细胞发生靶向核脱颗粒,此过程涉及细胞骨架重排、CD44从细胞膜脱落经importin转运至核膜,通过ERM锚定F-actin,驱动嗜苯胺蓝颗粒沿微管移动并与核膜融合,释放MPO进入细胞核,促进NETs形成,加速肺部炎症。
主要证据
人外周血中性粒细胞显示靶向核脱颗粒增强,表现为MPO核转位、CD63与核膜共定位增加;DSS小鼠中,肠壁注射的中性粒细胞迁移至肺部并高表达citH3;LPS诱导后,DSS小鼠肺组织NETs增多,炎症因子升高,肺水肿加重。
研究意义
为炎症性肠病患者的肺部感染管理提供了新的见解和潜在的治疗靶点,揭示了肺-肠串扰中性粒细胞迁移的新机制。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

患者中性粒细胞功能评估

评估溃疡性结肠炎患者外周血中性粒细胞的功能状态。

分离15名UC患者和15名健康志愿者外周血中性粒细胞,检测ROS释放、吞噬功能、脱颗粒、MPO水平、趋化性、NETs形成和凋亡。

2

验证患者中性粒细胞靶向核脱颗粒

确认UC患者中性粒细胞是否发生靶向核脱颗粒及其不可逆性。

通过TUNEL染色、citH3表达、MPO核内表达、电镜观察颗粒-核膜融合、CD63与laminB共定位等实验。

3

建立DSS结肠炎模型及中性粒细胞迁移观察

验证肠道中性粒细胞是否发生反向迁移至肺部。

使用DSS诱导小鼠结肠炎,将外源标记的中性粒细胞注入肠黏膜,6小时后通过组织透明化和共聚焦显微镜检测肺部的中性粒细胞。

4

评估DSS小鼠肺部感染炎症程度

明确DSS小鼠在肺部感染后是否表现出更严重的炎症。

通过鼻内给予LPS诱导肺部感染,比较DSS小鼠和WT小鼠的肺部中性粒细胞浸润、肺水肿、炎症因子、MPO水平和NETs。

5

探索靶向核脱颗粒的机制

揭示颗粒与核膜融合及细胞骨架变化在靶向核脱颗粒中的作用。

使用地塞米松稳定膜,抑制膜融合;使用细胞松弛素和importin抑制剂和dynarrestin抑制细胞骨架和货物转运,观察对MPO核转位和NETs形成的影响。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
中性粒细胞分离试剂盒STEMCELL Technologies#18103
中性粒细胞分离试剂盒STEMCELL Technologies#19666
RPMI-1640培养基Gibco--
胎牛血清----
葡聚糖硫酸钠MP Biomedicals--
水合氯醛----
细胞死亡检测ELISA试剂盒Roche--
抗人MPO抗体RDDY3174
TMB底物----
核和胞质提取试剂Thermo78835
抗MPO抗体Abcamab208670
抗CD63抗体Abcamab271286
抗LaminB1抗体Abcamab16048
抗瓜氨酸化组蛋白H3抗体Abcamab219407
DAPISolarbioD6470
抗CD63抗体Abcamab227892
Zeiss LSM 900共聚焦显微镜Zeiss--
抗CD63抗体(PE)BioLegend353010
抗CD35抗体(FITC)BD565330
TUNEL检测试剂盒BD561425
Annexin V/7-AADBD559763
CM-H2DCFDASolarbioD6470
佛波酯Solarbio--
抗Ly6G抗体Abcamab238132
抗citH3抗体Abcamab219407
抗MPO抗体Abcamab208670
DAPIServicebioG1012
MPO ELISA试剂盒RDDY9167-05
sTM ELISA试剂盒ElabscienceE-EL-H0166c
MPO活性检测试剂盒SigmaMAK068
二苄基醚----
Zeiss光片显微镜Zeiss--
GraphPad Prism 8.0GraphPad--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
患者样本采集
UC患者和健康志愿者各15例,外周血采集
阅读提示:Ethical statement部分
中性粒细胞分离
使用STEMCELL Technologies中性粒细胞分离试剂盒,编号#18103和#19666
阅读提示:Neutrophil extraction部分
DSS结肠炎模型
C57BL/6小鼠,8周龄,2.0% DSS饮水7天
阅读提示:Mice部分
肠道-肺迁移实验
外源标记中性粒细胞注入肠黏膜,6小时后检测肺部
阅读提示:Results部分 Figure 3
肺部感染模型
LPS经鼻内给药,6小时后观察,并检测湿干比、炎症因子、MPO、NETs
阅读提示:Results部分 Figure 4
靶向核脱颗粒机制研究
使用地塞米松、细胞松弛素B、importin抑制剂、dynarrestin等处理,具体浓度未明确
阅读提示:Results部分 Figure 5, 6