患者中性粒细胞功能评估
评估溃疡性结肠炎患者外周血中性粒细胞的功能状态。
分离15名UC患者和15名健康志愿者外周血中性粒细胞,检测ROS释放、吞噬功能、脱颗粒、MPO水平、趋化性、NETs形成和凋亡。
Targeted nuclear degranulation of neutrophils promotes the progression of pneumonia in ulcerative colitis.
包含患者样本、体外细胞实验、DSS小鼠模型及体内迁移验证,并涉及功能验证和机制研究。
DSS诱导的结肠炎小鼠模型 小鼠中性粒细胞 人外周血中性粒细胞
患者与健康志愿者外周血中性粒细胞比较,每组15例 DSS小鼠造模:2.0% DSS饮水7天 外源中性粒细胞注入肠黏膜并6小时后检测肺部迁移 LPS鼻内给药诱导肺部感染模型 使用PMA和LPS刺激中性粒细胞研究NETs形成
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估溃疡性结肠炎患者外周血中性粒细胞的功能状态。
分离15名UC患者和15名健康志愿者外周血中性粒细胞,检测ROS释放、吞噬功能、脱颗粒、MPO水平、趋化性、NETs形成和凋亡。
确认UC患者中性粒细胞是否发生靶向核脱颗粒及其不可逆性。
通过TUNEL染色、citH3表达、MPO核内表达、电镜观察颗粒-核膜融合、CD63与laminB共定位等实验。
验证肠道中性粒细胞是否发生反向迁移至肺部。
使用DSS诱导小鼠结肠炎,将外源标记的中性粒细胞注入肠黏膜,6小时后通过组织透明化和共聚焦显微镜检测肺部的中性粒细胞。
明确DSS小鼠在肺部感染后是否表现出更严重的炎症。
通过鼻内给予LPS诱导肺部感染,比较DSS小鼠和WT小鼠的肺部中性粒细胞浸润、肺水肿、炎症因子、MPO水平和NETs。
揭示颗粒与核膜融合及细胞骨架变化在靶向核脱颗粒中的作用。
使用地塞米松稳定膜,抑制膜融合;使用细胞松弛素和importin抑制剂和dynarrestin抑制细胞骨架和货物转运,观察对MPO核转位和NETs形成的影响。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 中性粒细胞分离 | 中性粒细胞分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | #18103 |
| 中性粒细胞分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | #19666 | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 动物模型 | 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | -- |
| 麻醉 | 水合氯醛 | -- | -- |
| NETs检测 | 细胞死亡检测ELISA试剂盒 | Roche | -- |
| 抗人MPO抗体 | RD | DY3174 | |
| TMB底物 | -- | -- | |
| 蛋白提取 | 核和胞质提取试剂 | Thermo | 78835 |
| Western blot | 抗MPO抗体 | Abcam | ab208670 |
| 抗CD63抗体 | Abcam | ab271286 | |
| 抗LaminB1抗体 | Abcam | ab16048 | |
| 免疫荧光 | 抗瓜氨酸化组蛋白H3抗体 | Abcam | ab219407 |
| DAPI | Solarbio | D6470 | |
| 抗CD63抗体 | Abcam | ab227892 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss LSM 900共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 流式细胞术 | 抗CD63抗体(PE) | BioLegend | 353010 |
| 抗CD35抗体(FITC) | BD | 565330 | |
| TUNEL检测试剂盒 | BD | 561425 | |
| Annexin V/7-AAD | BD | 559763 | |
| CM-H2DCFDA | Solarbio | D6470 | |
| 刺激 | 佛波酯 | Solarbio | -- |
| 免疫组化 | 抗Ly6G抗体 | Abcam | ab238132 |
| 抗citH3抗体 | Abcam | ab219407 | |
| 抗MPO抗体 | Abcam | ab208670 | |
| DAPI | Servicebio | G1012 | |
| ELISA | MPO ELISA试剂盒 | RD | DY9167-05 |
| sTM ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H0166c | |
| MPO活性检测试剂盒 | Sigma | MAK068 | |
| 组织透明化 | 二苄基醚 | -- | -- |
| 光片显微镜 | Zeiss光片显微镜 | Zeiss | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8.0 | GraphPad | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本采集 | UC患者和健康志愿者各15例,外周血采集 阅读提示:Ethical statement部分 |
| 中性粒细胞分离 | 使用STEMCELL Technologies中性粒细胞分离试剂盒,编号#18103和#19666 阅读提示:Neutrophil extraction部分 |
| DSS结肠炎模型 | C57BL/6小鼠,8周龄,2.0% DSS饮水7天 阅读提示:Mice部分 |
| 肠道-肺迁移实验 | 外源标记中性粒细胞注入肠黏膜,6小时后检测肺部 阅读提示:Results部分 Figure 3 |
| 肺部感染模型 | LPS经鼻内给药,6小时后观察,并检测湿干比、炎症因子、MPO、NETs 阅读提示:Results部分 Figure 4 |
| 靶向核脱颗粒机制研究 | 使用地塞米松、细胞松弛素B、importin抑制剂、dynarrestin等处理,具体浓度未明确 阅读提示:Results部分 Figure 5, 6 |