样本收集与RNA-seq
鉴定大卵泡和小卵泡中差异表达的circRNA。
从5只雷州山羊收集大卵泡和小卵泡，提取RNA，构建cDNA文库，使用Illumina HiSeq平台进行双端测序。
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鉴定调控山羊卵泡发育的功能性circRNA
Identification of functional circRNAs regulating ovarian follicle development in goats.
实验完整度
高包含RNA-seq转录组分析、qPCR/蛋白质印迹验证、以及细胞功能实验（EDU、流式细胞术）等多层级验证。
主要模型
雷州山羊大卵泡（直径>6 mm）和小卵泡（1 mm<直径<3 mm） 山羊卵泡颗粒细胞（GCs） 293T细胞
重点核对
circCFAP20DC过表达载体pLC5-circCFAP20DC的构建 circCFAP20DC过表达组与NC组的比较 细胞培养条件（90% DMEM/F12, 10% FBS, 1% PS） EdU实验（100 μM EDU孵育2小时） 细胞周期检测（流式细胞术，488 nm激发波长）
摘要
背景：环状RNA（circRNA）在哺乳动物的多种生物过程中发挥重要的调控作用。山羊的多胎性状受多种因素影响，但circRNA在山羊卵泡发育中的表达和功能尚不清楚。在本研究中，我们旨在探讨circRNA可能的调控机制，并收集了发情期雷州山羊的五组大卵泡（卵泡直径>6 mm）和小卵泡（1 mm<卵泡直径<3 mm）进行RNA测序。结果：RNA测序显示，小卵泡和大卵泡中有152个circRNA差异表达。其中，101个circRNA在大卵泡中上调，51个circRNA在小卵泡中上调。GO和KEGG富集分析显示，差异circRNA的宿主基因显著富集在重要通路中，如卵巢类固醇生成、GnRH信号通路、动物自噬和催产素信号通路。生物信号分析显示，152个差异表达的circRNA可以靶向91个差异miRNA，包括miR-101家族（chi-miR-101-3p， chi-miR-101-5p）、miR-202家族（chi-miR-202-5p， chi-miR-202-3p），60个circRNA具有翻译潜力。基于预测的测序结果，本研究构建了ceRNA网络chicirc_008762/chi-miR-338-3p/ARHGAP18和chicirc_040444/chi-miR-338-3p/STAR。重要的是，新基因circCFAP20DC在山羊中首次发现。EDU实验和流式细胞术结果表明，circCFAP20DC增强了卵泡颗粒细胞（GCs）的增殖。实时定量PCR和western blotting实验表明，circCFAP20DC激活视网膜母细胞瘤（RB）通路，促进颗粒细胞从G1期向S期进展。结论：山羊大小卵泡中的差异circRNA可能对卵泡发育具有重要的生物学功能。新基因circCFAP20DC激活RB通路，促进GCs从G1期向S期进展。这反过来又增强了山羊卵泡GCs的增殖。补充信息：在线版本包含补充材料，可在10.1186/s12864-024-10834-w获取。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circRNA在山羊卵泡发育中的表达和功能是什么？
- 核心机制
- circCFAP20DC通过激活RB通路，促进颗粒细胞从G1期向S期转变，从而增强细胞增殖。
- 主要证据
- RNA-seq鉴定差异circRNA；EDU和流式细胞术显示circCFAP20DC促进增殖和S期比例增加；qPCR和Western blot显示RB通路相关蛋白（p-RB, CDK2, CCNE2）上调。
- 研究意义
- 为理解山羊卵泡发育的分子机制提供理论基础，并为地方品种资源保护及山羊多胎性状候选基因鉴定提供基础数据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circRNA鉴定与差异表达分析
确定circRNA表达差异。
使用find_circ鉴定circRNA，使用DESeq进行差异表达分析。
ceRNA网络构建
预测circRNA-miRNA-mRNA调控网络。
使用miRanda预测miRNA靶基因，结合mRNA数据构建ceRNA网络。
circCFAP20DC鉴定
验证circCFAP20DC的环状结构和稳定性。
设计引物进行PCR、TA克隆、Sanger测序、RNase R处理、核质分离实验。
细胞功能实验
检测circCFAP20DC对颗粒细胞增殖和细胞周期的影响。
构建过表达载体，感染颗粒细胞，进行EdU实验和流式细胞术。
分子机制验证
验证circCFAP20DC对RB通路和增殖相关基因表达的影响。
提取RNA进行qPCR检测增殖和细胞周期相关基因，提取蛋白进行Western blot检测RB通路蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| TRIzol试剂 | TaKaRa | -- | |
| RNA完整性检测 | Nanophotometer®分光光度计 | IMPLEN | -- |
| rRNA去除 | rRNA去除试剂盒 | Illumina | -- |
| cDNA合成 | 逆转录酶 | Invitrogen | -- |
| cDNA第二链合成 | DNA聚合酶 | NEB | -- |
| RNase H | NEB | -- | |
| cDNA合成 | PrimeScript™ RT试剂盒 | TaKaRa | -- |
| PCR扩增 | 2×Pro Taq预混液 | -- | -- |
| qPCR | Tap Pro Universal SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- |
| 全长扩增 | PrimeSTAR® Max DNA聚合酶 | Takara | -- |
| DNA回收 | FastPure凝胶DNA提取迷你试剂盒 | Vazyme | -- |
| TA克隆 | pMD™ 19-T载体克隆试剂盒 | Takara | -- |
| RNase R处理 | GSPure® RNase R试剂盒 | Geneseed | -- |
| 逆转录 | Evo M-MLV RT反应混合物Ver.2试剂盒 | Accurate Bioiogy | -- |
| 载体构建 | Hieff Clone® Plus一步克隆试剂盒 | Yeasen | -- |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 病毒浓缩 | 通用病毒浓缩试剂盒 | Beyotime | -- |
| 核质分离 | FastPure细胞质和细胞核RNA纯化试剂盒 | ECOTOP | -- |
| EdU实验 | Cell-LightTM EDU Apollo体外试剂盒 | RIBOBIO | -- |
| 细胞周期检测 | 细胞周期检测试剂盒（红色荧光） | Elabscience | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白上样缓冲液 | 5×SDS-PAGE上样缓冲液 | Solarbio | -- |
| Western blot | 聚偏二氟乙烯膜 | Merck | -- |
| 载体构建 | pLC5-ciR载体 | Geneseed | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集 | 5只空怀健康雷州山羊，2岁，3胎次，发情鉴定后24小时内安乐死；每只提供一个大卵泡和2-3个小卵泡。 阅读提示：Methods: Sample collection |
| RNA-seq文库构建 | RNA起始量3 μg；片段化至200-300 bp；文库片段筛选300-400 bp；测序平台Illumina HiSeq，双端测序。 阅读提示：Methods: cDNA library preparation |
| circRNA差异表达分析 | 差异表达阈值：|log2FoldChange| > 1，P < 0.05。 阅读提示：Methods: circRNA identification and differential analysis |
| 细胞培养与病毒感染 | 颗粒细胞培养基：90% DMEM/F12, 10% FBS, 1% PS；感染时细胞融合度50%，感染后72小时收样。 阅读提示：Methods: Vector construction and lentiviral packaging |
| EdU实验 | 细胞接种96孔板4×10^4细胞/孔；感染后72小时加入100 μM EdU孵育2小时。 阅读提示：Methods: EdU cell proliferation |
| 细胞周期检测 | 细胞接种6孔板，感染后72小时收集细胞；使用Cell Cycle Assay Kit (Red Fluorescence)检测，激发波长488 nm。 阅读提示：Methods: Cell cycle assays |
| Western blot | 蛋白提取在感染后72小时；使用RIPA裂解液；SDS-PAGE胶浓度10%；PVDF膜。 阅读提示：Methods: Western blot |
| 统计检验 | 所有实验组设三个生物学重复；数据以均值±标准差表示；t检验用于两组比较，单因素方差分析用于多组比较；显著性阈值P<0.05。 阅读提示：Methods: Statistical analysis |