逆转录病毒载体的瞬时生产
产生编码CAR、ADA1和CD26的逆转录病毒载体，用于转导T细胞。
使用GeneJuice转染试剂将质粒DNA（Peq-Pam3、RDF和CAR或MR质粒）转染至HEK293T细胞，48小时和72小时后收集含病毒的培养基，过滤后分装冻存或立即用于转导。
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制备代谢重编程的人类CAR T细胞并评估其体外效应的方案
Protocol for preparing metabolically reprogrammed human CAR T cells and evaluating their in vitro effects.
实验完整度
中该文献为实验方案，详细描述了逆转录病毒生产、CAR T细胞生成及体外功能检测，但未包含体内动物实验或患者样本验证，证据层级有限。
主要模型
人外周血单个核细胞（PBMC）来源的CAR T细胞 293T细胞 A549细胞 HepG2细胞
重点核对
PBMC来源：人外周血单个核细胞（STEMCELL, Cat# 70025） 转导效率：流式细胞术检测CAR表达，通常在第5至10天评估转导效率 细胞毒性分析：与肿瘤细胞共培养，效应细胞与靶细胞比例1:1、5:1、10:1或20:1，检测时间点4、18、24小时 迁移分析：使用5μm孔径的Transwell，肿瘤细胞上清作为趋化因子，检测时间点2、4、22/24小时 RNA-seq分析：输入RNA 3μg，RIN≥6.0，使用STAR比对，DESeq2差异表达，GSEA分析
摘要
嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法代表了一种前沿的癌症治疗方法，使得CAR T细胞的开发与测试对推进这一治疗策略至关重要。我们提出了一种通过过表达腺苷脱氨酶1（ADA1）和CD26（也称为二肽基肽酶4或DPP4）来创建和表征人表皮生长因子受体2（HER2）和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC3）代谢重编程（MR）-CAR T细胞的方案。该方法有效地将免疫抑制性腺苷转化为肌苷，这支持T细胞在葡萄糖缺乏的肿瘤微环境中的存活。该方案包括产生逆转录病毒载体、生成CAR T细胞，以及进行外切ADA1活性、细胞毒性、细胞迁移和RNA测序分析。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 建立制备和表征HER2和GPC3代谢重编程CAR T细胞的方案，并评估其体外效应，以提升CAR T细胞在肿瘤微环境中的存活和功能。
- 核心机制
- 过表达ADA1和CD26将腺苷转化为肌苷，支持T细胞在葡萄糖缺乏的肿瘤微环境中存活。
- 主要证据
- 通过逆转录病毒转导PBMC产生CAR T细胞，进行外切ADA1活性、细胞毒性、细胞迁移和RNA-seq分析，验证其体外功能。
- 研究意义
- 该方案旨在为研究代谢重编程CAR T细胞提供详细步骤，以促进CAR T细胞疗法的开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
人PBMC的活化
通过抗CD3和抗CD28抗体刺激人PBMC，使其活化增殖，以制备适合转导的T细胞。
将人PBMC在抗CD3/CD28抗体包被的培养板中培养，加入IL-2，在37°C、5% CO2条件下孵育48小时。
T细胞的逆转录病毒转导
将逆转录病毒载体导入活化的T细胞，使其表达CAR和/或MR（CD26和ADA1）。
将逆转录病毒上清加入到RetroNectin包被的非组织培养处理24孔板中，加入活化T细胞，离心促进转导，然后孵育48小时。
CAR T细胞的扩增和转导效率评估
扩增转导后的CAR T细胞，并通过流式细胞术评估CAR表达。
每2-3天添加新鲜R10培养基和IL-2，维持细胞浓度在0.5×10^6至2×10^6 cells/mL之间。在第5至10天收集细胞进行流式细胞术分析以检测CAR表达。
外切ADA1活性分析
测定CAR T细胞膜上的ADA1酶活性。
将CAR T细胞重悬于R10培养基中，以2×10^6 cells/mL浓度接种于96孔板，孵育24小时，然后使用腺苷脱氨酶检测试剂盒测定ADA活性。
体外细胞毒性分析（LDH）
定量评估CAR T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
将肿瘤细胞（HepG2、Huh7、Calu3或A549）与不同效应细胞（CAR T、MR-CAR T或非转导T）以不同效靶比共培养，在4、18和24小时取样，通过LDH释放法计算特异性裂解率。
细胞迁移分析
检测CAR T细胞向趋化因子（肿瘤细胞条件培养基）的迁移能力。
将T细胞加入Transwell上室，下室加入肿瘤细胞上清和培养基，孵育后计数迁移到下室的细胞。
RNA测序及分析
通过转录组分析比较不同组别CAR T细胞的基因表达差异。
培养CAR T细胞和非转导T细胞6天，提取总RNA（3μg），送至测序服务商进行RNA-seq，然后利用STAR比对、htseq-count定量、DESeq2差异表达分析及GSEA进行基因集富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Corning | Cat# 10-040-CV |
| DMEM培养基 | Corning | Cat# 10-013-CV | |
| 胎牛血清 | Gibco | Cat# 16140071 | |
| 抗人CD3抗体 | Miltenyi Biotec | Cat# 130-093-387 | |
| 抗人CD28抗体 | BD Biosciences | Cat# 567117 | |
| T细胞激活 | 白细胞介素-2 | PeproTech | Cat# 200-02 |
| 逆转录病毒生产 | GeneJuice转染试剂 | Novagen | Cat# 70967-3 |
| T细胞转导 | RetroNectin | Takara | Cat# T100 A/B |
| 外切ADA1活性检测 | 腺苷脱氨酶检测试剂盒 | GenWay Biotech | Cat# GWB-BQK080 |
| 细胞毒性检测 | LDH细胞毒性WST检测试剂盒 | Enzo Life Sciences | Cat# ENZ-KIT157 |
| 细胞迁移检测 | 细胞迁移/趋化检测试剂盒（24孔，5 μm） | Abcam | Cat# ab235696 |
| 转染细胞系 | 293T细胞 | ATCC | Cat# CRL-3216 |
| 肿瘤细胞系 | A549细胞 | ATCC | Cat# CCL-185 |
| Calu3细胞 | ATCC | Cat# HTB-55 | |
| HepG2细胞 | ATCC | Cat# HB-8065 | |
| Huh-7细胞 | Dr. Andras Heczey | N/A | |
| PBMC来源 | 人外周血单个核细胞 | STEMCELL | Cat# 70025 |
| 流式细胞术 | 染色缓冲液 | BD Pharmingen | Cat# 554657 |
| Alexa Fluor 647标记的山羊抗小鼠IgG F(ab')₂片段 | Jackson ImmunoResearch | Cat# 115-605-006 | |
| 山羊IgG-AF647 | SouthernBiotech | Cat# 0109-31 | |
| 重组人ErbB2/Her2 Fc His Alexa Fluor 647蛋白 | Bio-Techne | Cat# AFR1129 | |
| RNA-seq | RNeasy Plus微型试剂盒 | Qiagen | 文中未明确说明 |
| TapeStation系统 | Azenta | -- | |
| 细胞培养耗材 | 6孔细胞培养板 | VWR | Cat# 10861-696 |
| 12孔细胞培养板 | VWR | Cat# 10861-698 | |
| 24孔细胞培养板 | Falcon | REF# 353047 | |
| 96孔细胞培养板 | Falcon | REF# 353072 | |
| 非组织培养处理24孔板 | VWR | Cat# 10861-558 | |
| 10厘米细胞培养皿 | VWR | Cat# 10861-680 | |
| 聚苯乙烯圆底试管 | Falcon | REF# 352052 | |
| 病毒上清过滤 | Millex-HV 0.45 μm注射器过滤器 | Millipore | REF# SLHVR33RS |
| 细胞迁移检测 | 带5.0 μm孔径聚碳酸酯膜插件的Transwell | Corning | REF# 3421 |
| 设备 | SX4750转子的多孔板载体 | Beckman | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 逆转录病毒生产 | HEK293T细胞密度（3×10^6 cells/10cm皿）、转染DNA量（10μg）及质粒比例（Peq-Pam3: RDF: 质粒 = 3.75:2.5:3.75）、转染试剂GeneJuice用量（30μL）、病毒上清收集时间（48h和72h） 阅读提示：参见‘Transient retrovirus production’步骤，尤其是步骤1-3 |
| T细胞激活 | 抗CD3/CD28抗体包被浓度（各1 μg/mL）、PBMC起始量（0.5×10^6/mL）、IL-2浓度（100 IU/mL）、激活时间（48h） 阅读提示：参见‘Activation of human PBMCs’步骤6-7 |
| T细胞转导 | RetroNectin包被浓度（10 μg/mL）、病毒上清量（1 mL/孔，共转导时各1 mL）、离心条件（4600×g, 1h, 30°C）、T细胞密度（0.25×10^6/mL）、共培养时间（48h） 阅读提示：参见‘Retroviral transduction of T cells’步骤8-9 |
| CAR T细胞扩增 | 细胞密度维持范围（0.5×10^6至2×10^6 cells/mL）、IL-2浓度（100 IU/mL） 阅读提示：参见‘Expanding CAR T cells and assessing transduction efficiency’步骤11 |
| 细胞毒性检测 | 效靶比（1:1、5:1、10:1、20:1）、共培养时间（4h、18h、24h）、检测波长（490nm） 阅读提示：参见‘In vitro LDH cytotoxicity assay’步骤18-25 |
| 细胞迁移检测 | Transwell孔径（5 μm）、上室细胞数（5×10^5 cells）、下室组成（235 μL上清+365 μL无血清培养基）、检测时间点（2、4、22/24h） 阅读提示：参见‘Cell migration assay’步骤31-37 |
| RNA-seq | RNA质量（RIN≥6.0）、RNA量（3μg）、参考基因组（GRCh38）、比对工具（STAR 2.7.2b）、定量工具（htseq-count 0.11.0）、差异表达工具（DESeq2 3.5）、GSEA版本（4.0.3） 阅读提示：参见‘RNA seq assay’步骤38-47 |