筛选和鉴定铁死亡相关lncRNA
筛选与铁死亡相关的lncRNA，并鉴定LncRNA-HMG
利用TCGA数据分析铁死亡相关lncRNA，在PKU癌症医院队列中验证表达，并在耐药细胞中检测表达，通过RACE获取全长序列，亚细胞定位分析。
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LncRNA-HMG通过抑制p53介导的铁死亡激发结直肠癌细胞化疗耐药
LncRNA-HMG incites colorectal cancer cells to chemoresistance via repressing p53-mediated ferroptosis.
实验完整度
高研究包含体外细胞实验（铁死亡、增殖、耐药）、体内异种移植和PDX模型，以及机制验证（RIP、RNA pull-down、泛素化、ChIP等），证据层级丰富。
主要模型
CRC细胞系（LoVo、HCT116、SW480等） 结肠上皮细胞NCM460 5-Fu/奥沙利铂耐药CRC细胞 裸鼠异种移植模型 患者来源异种移植（PDX）模型
重点核对
LncRNA-HMG在CRC组织和细胞系中的表达水平（RT-qPCR） LncRNA-HMG敲低或过表达对铁死亡的影响（Erastin处理、ROS、脂质过氧化、GSH/GSSG） LncRNA-HMG对化疗药物（5-Fu、奥沙利铂）敏感性的影响（IC50、克隆形成） LncRNA-HMG与p53、MDM2的相互作用（RIP、RNA pull-down） 体内实验中LncRNA-HMG ASO的给药方案（10 nmol/次，瘤内注射）及化疗方案（5-Fu 20 mg/kg，奥沙利铂6 mg/kg，腹膜内注射）
摘要
化疗时，过量的活性氧（ROS）常导致癌细胞产生大量脂质过氧化物并诱导细胞死亡，即铁死亡。清除ROS对于肿瘤细胞逃避铁死亡和获得耐药性至关重要。然而，长链非编码RNA（lncRNAs）在ROS代谢和肿瘤耐药中的确切功能仍不清楚。在本研究中，我们通过高通量筛选鉴定出LncRNA-HMG为结直肠癌（CRC）中与化疗耐药相关的lncRNA。LncRNA-HMG的异常高表达预示CRC患者预后较差。同时，我们发现LncRNA-HMG在化疗时保护CRC细胞免于铁死亡，从而增强CRC细胞的耐药性。LncRNA-HMG与p53结合并促进MDM2介导的p53降解。p53减少导致SLC7A11和VKORC1L1上调，这有助于增加还原剂供应并清除过量ROS。因此，CRC细胞逃避铁死亡并获得化疗耐药。重要的是，用反义寡核苷酸（ASO）抑制LncRNA-HMG能显著增敏CRC细胞对化疗的反应（在患者来源异种移植模型中）。LncRNA-HMG也是β-catenin/TCF的转录靶标，激活的Wnt信号触发LncRNA-HMG显著上调。总之，这些发现表明LncRNA-HMG促进CRC化疗耐药，并可能成为CRC的预后或治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LncRNA-HMG是否通过调控ROS代谢和铁死亡影响结直肠癌的化疗耐药？
- 核心机制
- LncRNA-HMG作为支架分子同时结合p53和MDM2，促进MDM2介导的p53泛素化降解，导致p53靶基因SLC7A11和VKORC1L1表达上调，增加还原剂供应，清除ROS和脂质过氧化物，抑制铁死亡，从而增强化疗耐药。
- 主要证据
- 体外实验显示敲低LncRNA-HMG增加ROS和脂质过氧化、降低GSH/GSSG，并增敏细胞对Erastin和化疗药物的敏感性；过表达则相反。RIP、RNA pull-down和泛素化实验证实LncRNA-HMG与p53、MDM2结合并促进p53泛素化。HCT116 p53−/−细胞中LncRNA-HMG对SLC7A11及GSH/GSSG无影响，证明其作用依赖p53。体内异种移植和PDX模型显示ASO抑制LncRNA-HMG增敏化疗。
- 研究意义
- 该研究揭示LncRNA-HMG是Wnt/β-catenin信号的下游靶标，连接Wnt通路与p53通路，可能作为CRC的预后标志物或治疗靶点，为开发靶向LncRNA-HMG的ASO药物提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估LncRNA-HMG与预后的关系
分析LncRNA-HMG表达水平与CRC患者预后的相关性
使用Cox回归分析评估LncRNA-HMG是否为独立预后因素，并比较高低表达组的总生存期。
验证LncRNA-HMG对铁死亡的影响
验证LncRNA-HMG是否影响CRC细胞对铁死亡的敏感性
通过敲低或过表达LncRNA-HMG，检测细胞活力、克隆形成、ROS水平、脂质过氧化、GSH/GSSG比值和线粒体形态。
验证LncRNA-HMG对化疗耐药的影响
验证LncRNA-HMG是否影响CRC细胞对化疗药物的敏感性
检测敲低或过表达LncRNA-HMG后细胞对5-Fu和奥沙利铂的IC50、克隆形成能力，以及化疗处理后的ROS、GSH/GSSG和线粒体形态。
探索LncRNA-HMG调控铁死亡和化疗耐药的分子机制
探究LncRNA-HMG调控p53信号通路及其下游靶标的机制
通过转录组测序和GSEA分析p53信号通路，通过质谱鉴定LncRNA-HMG结合蛋白，验证LncRNA-HMG与p53、MDM2的相互作用，检测p53稳定性及下游靶标表达。
验证LncRNA-HMG依赖p53调控ROS状态
确认LncRNA-HMG对SLC7A11表达和GSH/GSSG的影响依赖于p53
在HCT116 p53+/+和p53−/−细胞中敲低或过表达LncRNA-HMG，检测SLC7A11表达和GSH/GSSG比值。
体内验证LncRNA-HMG对化疗敏感性的影响
验证LncRNA-HMG在体内对CRC化疗敏感性的影响
建立异种移植和PDX模型，敲低LncRNA-HMG或使用ASO，结合化疗药物处理，评估肿瘤生长和分子标志物。
验证LncRNA-HMG是β-catenin的转录靶标
验证Wnt/β-catenin信号通路是否直接调节LncRNA-HMG转录
通过β-catenin过表达、LiCl处理、iCRT14抑制、ChIP和荧光素酶报告基因实验验证LncRNA-HMG启动子区域含有TCF结合元件。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 质粒构建 | pLKO.1载体 | -- | -- |
| pMD2.G包装质粒 | -- | -- | |
| psPAX2包装质粒 | -- | -- | |
| Western blot | 抗SLC7A11/xCT抗体 | ABclonal Technology | A2413 |
| 抗MDM2抗体 | ABclonal Technology | A13327 | |
| 抗β-Catenin抗体 | Cell Signaling Technology | 9562 | |
| 抗p53抗体 | Cell Signaling Technology | DO-1 | |
| 抗TCF4抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗泛素抗体 | Cell Signaling Technology | P4D1 | |
| 抗VKORC1L1抗体 | Absin | abs101967 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA纯化 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| cDNA合成 | SuperScript第一链合成系统 | Yeasen Biotechnology | -- |
| RACE | HiScript-TS 5/3 RACE试剂盒 | Vazyme | -- |
| IHC | UltraVision Quanto检测系统HRP DAB试剂盒 | ZSGB-Bio | -- |
| GSH/GSSG检测 | 还原型谷胱甘肽含量检测试剂盒 | Solarbio | -- |
| 脂质ROS检测 | C11-BODIPY荧光探针 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| MDA检测 | 丙二醛含量检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| ROS检测 | 活性氧荧光检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| 免疫沉淀 | Protein A-Sepharose磁珠 | GE Healthcare | -- |
| 荧光素酶报告基因 | 海肾荧光素酶对照报告载体 | Promega | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| RNA pull-down | 生物素标记RNA | Beyotime | -- |
| FISH | Ribo荧光原位杂交试剂盒 | RiboBio | -- |
| 细胞增殖 | 细胞计数试剂盒-8 | Yeasen Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| ChIP | 磁珠法ChIP试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| 动物实验 | 裸鼠 | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | -- |
| 5-氟尿嘧啶 | -- | -- | |
| 奥沙利铂 | -- | -- | |
| LncRNA-HMG反义寡核苷酸 | RiboBio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞系（LoVo、HCT116 p53+/+、HCT116 p53−/−、SW480）培养条件（DMEM+10% FBS）；LncRNA-HMG敲低/过表达效率；Erastin浓度（5 μM）和处理时间（8小时）；5-Fu和奥沙利铂浓度（5 μM和40 μM）及处理时间（24小时） 阅读提示：见Methods 4.2、4.16、4.17 及图2、3图注 |
| 铁死亡检测 | ROS检测试剂盒（DCFH-DA）使用步骤；C11-BODIPY浓度（2 μmol/L）及孵育时间（30 min）；GSH/GSSG检测试剂盒（Solarbio）及412 nm波长测定；MDA检测试剂盒及532 nm波长测定 阅读提示：见Methods 4.7-4.10 及图2图注 |
| 蛋白质检测 | 抗体信息及稀释比例（SLC7A11 A2413，MDM2 A13327，β-Catenin 9562，p53 DO-1，TCF4，Ub P4D1，VKORC1L1 abs101967）；CHX浓度（50 μg/mL）处理时间；MG132浓度（10 μM）处理时间（4小时） 阅读提示：见Methods 4.3、4.11 及图4、5图注 |
| RNA与转录调控检测 | RT-qPCR引物序列（见补充表S5）；RACE实验具体步骤；ChIP实验抗体（anti-TCF4、anti-β-catenin）；荧光素酶报告基因实验（共转染比例、检测系统） 阅读提示：见Methods 4.4、4.5、4.18、4.12 及图7图注 |
| 体内实验 | 异种移植模型：小鼠品系（5周龄雌性裸鼠）、每组数量（n=6）、细胞注射量、给药方案（5-Fu 20 mg/kg、奥沙利铂6 mg/kg腹膜内注射，每3天一次）、肿瘤体积测量公式（length × width² × 0.5） 阅读提示：见Methods 4.20 及图6图注 |
| PDX模型与ASO治疗 | PDX模型建立（F0、F2代）、ASO给药剂量（10 nmol/次）和途径（瘤内注射）、化疗药物剂量（5-Fu 20 mg/kg、奥沙利铂6 mg/kg）及给药频率（每3天一次） 阅读提示：见Methods 4.20 及图6图注 |