真菌筛选与提取物制备
确定在何种培养基和培养条件下产生的提取物具有抗炎活性。
使用四种液体培养基（A、B、C、D）在静置和振荡条件下培养真菌，制备次级代谢物的乙酸乙酯提取物（Sh F、Sh Cell、St F、St Cell）。
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Aspergillus unguis SP51-EGY的抗炎潜力：TLR4依赖性效应及通过Q-TOF LC-HRMS的化学多样性研究
Anti-inflammatory potential of aspergillus unguis SP51-EGY: TLR4-dependent effects & chemical diversity via Q-TOF LC-HRMS.
实验完整度
中包括细胞实验（NO、qPCR、ELISA、Western blot）和化合物鉴定，但缺乏动物模型或患者样本等第二层级验证，且未进行TLR4直接结合或敲除验证。
主要模型
RAW 264.7巨噬细胞 LPS刺激的RAW 264.7细胞炎症模型
重点核对
RAW 264.7细胞培养条件：DMEM+10%热灭活FBS+1%Pen-Strep，37°C，5% CO2 LPS刺激浓度：10 ng/mL，共处理24小时（NO、ELISA、Western blot）或6小时（qPCR） 真菌提取物处理浓度：10 µg/mL 细胞接种密度：1×10^6 cells/mL（96孔板或6孔板） qPCR内参基因：GAPDH，采用2^-ΔΔCT法
摘要
炎症是组织修复的一种复杂防御机制。然而，脂多糖（LPS）过度激活TLR4介导的炎症可导致脓毒症、急性肺损伤和慢性炎症等有害后果，且常与癌症和自身免疫性疾病相关。本研究探讨了“Aspergillus unguis分离株SP51-EGY”对LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞的抗炎特性。通过实时qPCR，我们评估了关键炎症基因iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6的表达水平。值得注意的是，我们的真菌提取物显著减少了NO的产生，并显著降低上述基因的mRNA表达水平。此外，虽然Nrf2通常与调节炎症反应相关，但我们的研究结果表明，提取物的抗炎作用并非依赖Nrf2。此外，通过Q-TOF LC-HRMS阐明了强效提取物（B Sh F）的化学多样性，鉴定出54种化合物，其中一些在抑制炎症中发挥重要作用。最值得注意的是，像格拉司琼、非诺贝特和伞形花内酯等化合物被发现通过NF-κB信号通路下调TNF-α、IL-1β和IL-6。总之，从埃及红海分离的“Aspergillus unguis分离株SP51-EGY”被揭示为一种有前景的TLR4抑制剂，具有显著的抗炎潜力，为其在炎症中的潜在治疗应用提供了新的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Aspergillus unguis SP51-EGY的提取物是否具有抗炎作用，其作用是否依赖于TLR4信号通路？
- 核心机制
- 真菌提取物通过下调iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6的表达来抑制炎症，且其作用不依赖Nrf2信号通路。
- 主要证据
- 在LPS刺激的RAW 264.7巨噬细胞中，提取物显著减少NO产生，降低iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6的mRNA表达，并降低TNF-α、IL-6和COX-2蛋白水平；Q-TOF LC-HRMS鉴定出54种化合物，其中granisetron、fenofibrate和umbelliprenin可能通过NF-κB通路发挥作用。
- 研究意义
- 该研究揭示了Aspergillus unguis SP51-EGY作为TLR4抑制剂的潜力，为炎症的潜在治疗应用提供了新见解，并强调了进一步研究其生物利用度和毒理学特征的必要性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测NO产生和细胞毒性
评估提取物对LPS诱导的NO产生的抑制作用，并排除细胞毒性。
RAW 264.7细胞经LPS刺激和提取物共处理，通过Griess法测定NO产生，MTT法测定细胞活力。
检测炎症基因mRNA表达
评估提取物对iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6 mRNA表达的影响。
LPS刺激和提取物共处理后，提取总RNA，逆转录cDNA，进行qPCR分析。
检测Nrf2下游基因表达
探究提取物的抗炎作用是否通过Nrf2信号通路介导。
通过qPCR检测Nrf2调控的ARE基因HO-1和OSGIN1的mRNA表达。
检测促炎细胞因子蛋白水平
验证mRNA水平的变化是否在蛋白质水平上体现。
使用ELISA检测TNF-α和IL-6的蛋白分泌水平。
检测COX-2蛋白表达
验证提取物对COX-2蛋白表达的抑制作用。
通过Western blot分析COX-2蛋白水平。
Q-TOF LC-HRMS化合物鉴定
鉴定强效抗炎提取物（B Sh F）中的化学成分。
使用Q-TOF LC-HRMS在正负离子模式下分析提取物，结合数据库鉴定了54种化合物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
化合物鉴定
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 细胞系 | RAW 264.7细胞系 | ATCC | TIB-71 |
| LPS刺激 | 脂多糖（大肠杆菌O111:B4） | Sigma-Aldrich | -- |
| RNA提取 | QIAzol裂解试剂 | Qiagen | -- |
| 无核酸酶水 | Qiagen | -- | |
| 溶剂 | 二甲基亚砜 | SERVA | -- |
| 甲醇 | SERVA | -- | |
| 氯仿 | SERVA | -- | |
| 异丙醇 | SERVA | -- | |
| 乙醇 | SERVA | -- | |
| NO检测 | Griess试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| MTT实验 | MTT | Thermo Fisher Scientific | -- |
| cDNA合成 | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| qPCR | PowerUp™ SYBR™ Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ABI Prism 7500实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | Pierce™ BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞裂解缓冲液（10X） | Cell Signaling | -- | |
| 蛋白酶抑制剂混合物（100X） | Cell Signaling | -- | |
| 预染蛋白分子量标准（广范围11-190 kDa） | Cell Signaling | -- | |
| COX-2多克隆抗体 | Elabscience | -- | |
| GAPDH多克隆抗体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 山羊抗兔IgG（H+L）二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Pierce™ ECL化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| ELISA | 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Elabscience | -- | |
| Q-TOF LC-HRMS | 6530四极杆飞行时间液质联用系统 | Agilent Technologies | -- |
| Zorbax RP-18色谱柱 | Agilent Technologies | -- | |
| MassHunter定性软件 | Agilent Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与刺激 | RAW 264.7细胞培养在含10%热灭活FBS和1% Pen-Strep的DMEM中，37°C，5% CO2；LPS（10 ng/mL）刺激，提取物（10 µg/mL）共处理时间（NO/ELISA/Western blot为24小时，qPCR为6小时）。 阅读提示：Materials and methods中的Cell culture、Determination of NO production、Isolation of total RNA等部分 |
| NO检测 | 细胞接种密度为1×10^6 cells/mL，Griess试剂用量及孵育时间，标准曲线（NaNO2），测量波长548 nm。 阅读提示：Materials and methods中的Determination of NO production using Griess method |
| MTT实验 | MTT溶液浓度（1 mg/mL），孵育时间（2小时），溶解DMSO量（100 µL），测量波长540 nm。 阅读提示：Materials and methods中的Determination of cytotoxicity using MTT assay |
| qPCR | RNA提取方法（QIAzol），cDNA合成试剂盒，qPCR反应条件（95°C 10分钟，40个循环95°C 15秒，60°C 1分钟），引物序列（表1），内参基因（GAPDH），相对定量方法（2^-ΔΔCT）。 阅读提示：Materials and methods中的Determination of inflammatory mRNA expression levels using quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR)和表1 |
| ELISA | 细胞上清液离心条件（1000×g，20分钟，4°C），稀释倍数（TNF-α 1:100，IL-6 1:20），检测波长450 nm。 阅读提示：Materials and methods中的Quantification of the pro-inflammatory cytokine protein levels using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) |
| Western blot | 蛋白提取（细胞裂解液+蛋白酶抑制剂），蛋白定量（BCA），蛋白上样量（10 µg），SDS-PAGE浓度（10%），转膜（PVDF膜），封闭（5%脱脂牛奶），一抗稀释度（COX-2 1:1000，GAPDH 1:2500），二抗稀释度（1:15000），显影底物（ECL）。 阅读提示：Materials and methods中的Western blotting |
| Q-TOF LC-HRMS | 色谱柱型号和规格，流动相（0.1%甲酸水溶液和乙腈），梯度洗脱程序，流速（0.3 mL/min），进样量（5 µL），MS参数（毛细管电压4500 V，气体温度200°C，干燥气流量8 L/min，碎裂电压130 V，碰撞能量10 V，质量范围50-3000 m/z）。 阅读提示：Materials and methods中的Q-TOF LC-HRMS spectroscopy analysis |