生产SARS-CoV-2刺突蛋白
为了降低成本，在实验室中生产刺突蛋白，并验证其表达。
使用刺突蛋白胞外域表达质粒转染HEK293T细胞，通过Western blot检测表达，并大规模纯化获得920 µg蛋白。
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建立用于筛选抗SARS-CoV-2蛋白抑制剂的内部检测方法
Establishment of in-house assay for screening of anti-SARS-CoV-2 protein inhibitors.
实验完整度
中包含蛋白质生产、Western blot验证、MTT细胞毒性实验和免疫荧光筛选实验，但缺乏体内实验和更深入的机制验证。
主要模型
HEK293T细胞 Vero细胞
重点核对
细胞系：HEK293T（ATCC® CRL-3216™）和Vero（ATCC® CCL-81™） 转染试剂：Lipofectamine 3000 化合物浓度范围：5 µg/mL至500 µg/mL 阳性对照：CNPs CC50和IC50计算：使用GraphPad Prism 8软件
摘要
开发一种有效的抗病毒药物来对抗2019冠状病毒病（COVID-19）至关重要，因为我们可能面临新病毒株的出现或另一场大流行的风险。SARS-CoV-2刺突蛋白与血管紧张素转换酶2（ACE2）之间的相互作用是病毒进入宿主细胞的主要蛋白-蛋白相互作用（PPI）。刺突蛋白-ACE2 PPI是药物干预的主要靶点。我们重新利用了一种先前描述的蛋白-蛋白相互作用检测方法，将其用作药物筛选检测。该检测使用壳聚糖纳米颗粒（CNPs）作为药物，SARS-CoV-2刺突蛋白-ACE2相互作用作为PPI模型进行标准化。然后使用该检测筛选四种天然生物活性化合物：姜黄素（Cur）、没食子酸（GA）、槲皮素（Q）和水飞蓟素（Sil），并在体外评估其细胞毒性。刺突蛋白的生产及其活性与标准商业蛋白的比较也是我们工作的一部分。在这里，我们描述了一种新型的简单免疫荧光筛选检测，用于识别潜在的SARS-CoV-2抑制剂，该检测可以评估任何配体对任何PPI的抑制作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 建立一种内部免疫荧光检测方法，用于筛选抑制SARS-CoV-2刺突蛋白与ACE2相互作用的化合物。
- 核心机制
- 化合物通过阻断刺突蛋白与ACE2之间的蛋白-蛋白相互作用来抑制病毒进入宿主细胞。
- 主要证据
- 使用免疫荧光检测，CNPs、姜黄素、没食子酸、槲皮素和水飞蓟素均表现出抑制活性，其中姜黄素IC50值最低（1.352 µg/mL），且该检测通过阳性和阴性对照验证了特异性。
- 研究意义
- 该检测方法成本低廉、可重复，适用于特定蛋白-蛋白相互作用的靶向药物筛选，但需要进一步体外和体内实验确认筛选化合物的抗病毒效果。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证刺突蛋白结合活性
比较自产刺突蛋白与商业刺突蛋白与ACE2的结合能力。
通过免疫荧光检测，使用两种浓度（10 nM和100 nM）的刺突蛋白，与固定的ACE2蛋白结合，检测荧光信号。
评估化合物细胞毒性
确定所选化合物对Vero细胞的半数细胞毒性浓度（CC50）。
使用MTT法检测不同浓度化合物处理48小时后的细胞活力，计算CC50。
标准化免疫荧光筛选检测
使用已知抑制剂CNPs优化检测条件，验证检测的特异性。
使用不同浓度的CNPs处理ACE2固定的玻片，通过荧光信号的变化检测抑制效果，并设置阴性和阳性对照。
筛选四种天然化合物
评估Cur、GA、Q和Sil对刺突蛋白-ACE2相互作用的抑制活性。
使用标准化的免疫荧光检测，在不同浓度下处理，计算IC50值。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | -- |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific, Gibco™ | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen, Inc. | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | -- |
| 质粒纯化 | PureLink™ HiPure质粒大提试剂盒 | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™ | K210006 |
| Western blot | PVDF膜 | Amersham | -- |
| ECL化学发光试剂盒 | Amersham | -- | |
| 蛋白纯化 | Strep-Tactin®XT离心柱 | iba-lifesciences | 2-4151-000 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | 23225 |
| 免疫荧光检测 | 重组人ACE2蛋白 | Elabscience | PKSH032068 |
| 重组2019-nCoV刺突蛋白 | Elabscience | PKSR030477 | |
| 兔抗刺突抗体 | Sino biological | 40591-T62 | |
| 刺突蛋白单克隆抗体 | Elabscience | E-AB-V1008 | |
| 山羊抗兔抗体 | Abcam | ab6721 | |
| 山羊抗人IgG FITC | Elabscience | E-AB-1019 | |
| MTT检测 | MTT染料 | Serva Electrophoresis GmbH | -- |
| 二甲基亚砜 | Serva Electrophoresis GmbH | -- | |
| 免疫荧光检测 | 3-氨丙基三乙氧基硅烷 | Sigma-Aldrich | -- |
| EDC（1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐） | Sigma-Aldrich | -- | |
| N-羟基琥珀酰亚胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 药物处理 | 姜黄素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 没食子酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 槲皮素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 水飞蓟素 | Sigma-Aldrich | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和转染 | 细胞系（HEK293T和Vero）、培养基（DMEM+10%FBS+2%青链霉素）、转染试剂（Lipofectamine 3000）、细胞密度（6×10^5/孔）、转染时间（72小时或48小时） 阅读提示：材料与方法：细胞系、质粒制备和转染 |
| 蛋白表达和纯化 | HEK293T细胞转染规模（6×10 cm平板）、裂解缓冲液（NP-40）、纯化柱类型（Strep-Tactin®XT）、定量方法（BCA） 阅读提示：材料与方法：蛋白质生产 |
| 细胞毒性检测 | Vero细胞密度（10^4/孔）、处理时间（48小时）、MTT浓度（0.5 mg/mL）、孵育时间（2小时） 阅读提示：材料与方法：细胞毒性MTT检测 |
| 免疫荧光筛选 | ACE2固定浓度（100 nM）、刺突蛋白浓度（10和100 nM）、抗体浓度（抗刺突抗体10 nM、二抗10 nM）、CNPs浓度（1-50 µg/mL） 阅读提示：材料与方法：免疫荧光检测标准化 |