CXCR3拮抗剂的虚拟筛选与鉴定
从化合物库中筛选能够结合CXCR3并抑制DENV复制的小分子。
构建CXCR3同源模型，对约110万化合物进行虚拟筛选，结合分子对接和MM-GBSA计算，获得13个候选分子，其中7D显示出显著的CXCR3结合能力。
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7D，一种通过分别经由CXCL4：CXCR3：p38：IRF3和Sirt1：STAT3轴增加干扰素和中和抗体来抑制登革热感染的小分子
7D, a small molecule inhibits dengue infection by increasing interferons and neutralizing-antibodies via CXCL4:CXCR3:p38:IRF3 and Sirt1:STAT3 axes respectively.
实验完整度
高研究包含体外细胞实验（单核细胞、巨核细胞、MEFs）、体内动物模型（AG129、C57BL6、CXCR3−/−小鼠）以及功能验证和机制验证（STAT3抑制剂、IFNλ阻断抗体）。
主要模型
U937-DC-SIGN细胞（体外DENV感染模型） AG129小鼠（IFNα/β/γR−/−，DENV2感染模型） C57BL/6小鼠（DENV2感染模型） CXCR3−/−小鼠（DENV2感染模型）
重点核对
7D给药剂量：8 mg/kg体重，每日一次，腹腔注射，持续4天 DENV2感染剂量和途径：AG129小鼠为1×10^5 FFU腹腔注射（P8-P23085 INDI-60），C57BL/6和CXCR3−/−小鼠为1×10^6 FFU腹腔注射（EU081177.1） STAT3抑制剂Stattic使用剂量：10 mg/kg体重/天，持续4天 7D体外使用浓度：5 μM（抑制CXCL4介导的DENV2复制）
摘要
针对登革热病毒（DENV）的有效疫苗数量有限，目前正在大力开发有效的抗病毒药物。此前，我们描述了血小板趋化因子CXCL4负向调节干扰素（IFN）-α/β合成并促进DENV2复制。CXCR3（CXCL4受体）的拮抗剂逆转了这一作用并抑制了病毒复制。在一项并行筛选中，我们从化合物库中鉴定出CXCR3拮抗剂，即7D，它在体外抑制了所有血清型的DENV。7D在血浆中的半衰期约为2.85小时，且无明显毒性，将7D（8 mg/kg体重）补充给DENV2感染的IFNα/β/γR−/−AG129或野生型C57BL6小鼠，增加了IFN-α/β和IFN-λ的合成，并改善了血小板减少、白细胞减少和血管渗漏等疾病症状，提高了存活率。7D具有抑制Sirt-1去乙酰化酶的特性，促进STAT3的乙酰化和磷酸化，进而增加浆母细胞增殖、生发中心成熟以及针对DENV2的中和抗体合成。STAT3抑制剂成功抑制了7D的这些效应。总之，这些观察结果确定化合物7D通过CXCL4：CXCR3：p38：IRF3信号通路刺激IFN-α/β/λ合成，并通过促进浆母细胞中STAT3乙酰化增强中和抗体的产生，能够保护登革热感染。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 研究旨在开发一种能够抑制登革热病毒感染的小分子化合物，并探讨其作用机制。
- 核心机制
- 7D通过CXCL4：CXCR3：p38：IRF3信号通路刺激IFN-α/β/λ的合成，并通过抑制Sirt1去乙酰化酶活性促进STAT3乙酰化和磷酸化，从而促进浆母细胞增殖和中和抗体生成。
- 主要证据
- 体外实验表明7D抑制DENV2在单核细胞中的复制，体内实验显示7D提高AG129和WT小鼠的IFN水平、降低病毒载量、改善症状并提高存活率，同时通过STAT3信号增强抗体反应；STAT3抑制剂Stattic处理抑制了7D的抗体增强效应。
- 研究意义
- 研究将7D确定为一种具有抗登革热潜力的化合物，既可作为IFN合成的刺激剂，又可作为中和抗体产生的增强剂，为开发针对所有血清型登革热的抗病毒药物提供了新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外抗病毒活性检测
评估7D对DENV复制的抑制作用及其细胞毒性。
在U937-DC-SIGN细胞中感染DENV2，检测7D对病毒基因组复制的影响，并计算EC50；同时检测7D对CXCL4增强作用的抑制效果及细胞活力。
机制验证：CXCR3和Sirt1依赖性的体外实验
确证7D的作用依赖CXCR3，并探究Sirt1的作用。
使用CXCR3+/+和CXCR3−/−小鼠单核细胞感染DENV2，比较7D的抑制效果；在Sirt1−/− MEFs中检测7D对DENV2复制的影响。
干扰素和STAT3信号通路分析
研究7D对IFN合成及STAT3乙酰化磷酸化的影响。
在体外细胞和体内小鼠中，通过qRT-PCR和Western blot检测IFN相关基因表达和P-p38、P-IRF3、Ac-STAT3、P-STAT3水平。
体内疗效评估
评估7D对DENV2感染小鼠的疾病症状、病毒载量和存活率的影响。
在AG129、C57BL/6和CXCR3−/−小鼠中建立DENV2感染模型，给予7D治疗，检测体重、存活率、血小板和白细胞计数、血管渗漏、病毒载量、细胞因子水平以及抗体反应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Sigma | R4130-1L |
| DMEM培养基 | Gibco | 12800-017 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| 病毒浓度 | Amicon过滤器 | Merck-Millipore | UFC9100 |
| 免疫荧光染色 | DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S |
| ProLong Gold抗淬灭剂 | Cell Signaling Technology | 9071S | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sigma | R0278 |
| 病毒感染 | DENV2抗原 | Microbix | EL-22-02 |
| qRT-PCR | cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 1708891 |
| SYBR绿色荧光定量PCR预混液 | Bio-Rad | 1725124 | |
| ELISA | TMB显色底物 | Thermo Fisher | 34022 |
| 终止液 | Thermo Fisher | N600 | |
| ELISA检测小鼠IFNα | 小鼠IFNα ELISA试剂盒 | Elabsciences | E-EL-M3054 |
| ELISA检测小鼠IFNβ | 小鼠IFNβ ELISA试剂盒 | Elabsciences | E-EL-M0033 |
| ELISA检测小鼠PF4 | 小鼠PF4 ELISA试剂盒 | R&D Systems | MCX400 |
| ELISA检测人PF4 | 人PF4 ELISA试剂盒 | Elabsciences | E-EL-H6184 |
| 细胞活力检测 | MTT | Himedia | RM1131 |
| 药物处理 | Stattic（STAT3抑制剂） | Target mol | T6308 |
| AMG487（CXCR3拮抗剂） | Medchem Express | HY-15319 | |
| 血管通透性测定 | 伊文思蓝染料 | Sigma | E2129 |
| CBA细胞因子检测 | IL-1β CBA试剂 | BD Biosciences | 560232 |
| TNF CBA试剂 | BD Biosciences | 558299 | |
| IL-6 CBA试剂 | BD Biosciences | 558301 | |
| ELISA检测IFNλ | 小鼠IFN-λ 2/3 ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY1789B-05 |
| 免疫印迹和流式细胞术 | 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700S |
| 抗P-STAT3 (Y705)抗体 | Cell Signaling Technology | 4113S | |
| 抗Acetyl-STAT3 (K685)抗体 | Cell Signaling Technology | 2523S | |
| 免疫印迹 | 抗STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 4904S |
| 抗SIRT1抗体 | Cell Signaling Technology | 8469S | |
| 抗P-p38抗体 | Cell Signaling Technology | 4511S | |
| 抗p38抗体 | Cell Signaling Technology | 9212S | |
| 抗IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4302S | |
| 抗P-IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 29047S | |
| 抗Acetyl-p53抗体 | Cell Signaling Technology | 2525S | |
| 抗p53抗体 | Cloud Clone | PAA928Hu01 | |
| 抗DENV NS1抗体 | Invitrogen | PA5-32207 | |
| 免疫荧光 | 抗dsRNA抗体 | Cell Signaling Technology | 76651L |
| 抗小鼠IgG二抗（AF488） | Invitrogen | A28175 | |
| 抗大鼠IgM二抗（Dylight650） | Invitrogen | SA5-10013 | |
| ELISA/ELISPOT | 生物素化抗小鼠IgG | Southern Biotech | 6170-08 |
| ELISA | 生物素化抗小鼠IgM | Southern Biotech | 1021-08 |
| HRP偶联抗小鼠IgG | Immunotag | 786-R38 | |
| HRP偶联抗兔IgG | Immunotag | 786-R39 | |
| 流式细胞术 | CD45-APC抗体 | BioLegend | 109814 |
| CD19-BV421抗体 | BioLegend | 115538 | |
| CD3-FITC抗体 | BioLegend | 100204 | |
| CD138-PE/CY7抗体 | BioLegend | 142514 | |
| B220-PE抗体 | BioLegend | 103208 | |
| LY6C-BV421抗体 | BioLegend | 128032 | |
| LY6G-FITC抗体 | Invitrogen | 11-9668-82 | |
| CD11b-PerCP/CY5.5抗体 | Invitrogen | 45-0112-82 | |
| CD41a-PE抗体 | Invitrogen | 12-0411-82 | |
| 免疫荧光组织化学 | GL7未偶联抗体 | BioLegend | 144602 |
| 荧光显微镜 | Leica共聚焦显微镜 DMI 6000 TCS-SP8 | Leica | -- |
| qRT-PCR | Quant Studio 6 Flex实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems (Thermo Scientific) | -- |
| 流式细胞术 | BD FACS-Verse流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| BD FACS-aria流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| ELISA读数 | SpectraMax i3x多功能酶标仪 | Molecular Devices | -- |
| ELISPOT | S6 Universal M2免疫斑点分析仪 | Immunospot | -- |
| 病毒测序 | Illumina MiSeq测序仪 | Illumina | -- |
| HPLC分析 | Agilent 1200 Infinity高效液相色谱系统 | Agilent | -- |
| 细胞培养 | 青霉素/链霉素 | Sigma | P4333 |
| Leibovitz L15培养基 | Himedia | AL011S | |
| 蛋白提取 | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Thermo Fisher | A32959 |
| RNA提取 | QIAamp病毒RNA小提试剂盒 | Qiagen | 52904 |
| 细胞培养 | Triton X100 | Sigma | T8787 |
| 牛血清白蛋白 | BioString | BS100053 | |
| 细胞分离 | CD61微磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-109-678 |
| ELISPOT显色 | AEC底物 | Vector Labs | SK-4200 |
| 溶解化合物 | 二甲基亚砜 | Sigma | D8418 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒扩增与滴定 | C6/36细胞培养条件和感染MOI（~0.1），病毒扩增时间（5天），浓缩方式（Amicon过滤器），滴定使用Vero E6细胞和4G2抗体 阅读提示：Methods：Cell culture and viruses |
| 体外抗病毒实验（U937-DC-SIGN） | 细胞感染MOI ~1，DENV2株（P23085 INDI-60），CXCL4浓度（100 ng/ml），7D浓度（5 μM），处理时间（24小时） 阅读提示：Methods：Cell culture and viruses；Figure 1F-G legend |
| 小鼠感染模型 | AG129小鼠DENV2（P8-P23085 INDI-60）感染剂量（105 FFU，腹腔注射），C57BL/6和CXCR3−/−小鼠DENV2（EU081177.1）感染剂量（106 FFU，腹腔注射），7D给药剂量（8 mg/kg体重，腹腔注射），治疗持续时间（4天） 阅读提示：Methods：Mouse infection |
| 中和抗体检测（FRNT） | Vero E6细胞，DENV2为50-60 FFU，血清梯度稀释，孵育时间（1小时），感染后培养时间（3天），4G2抗体染色 阅读提示：Methods：Neutralization assay |
| STAT3抑制实验 | Stattic给药剂量（10 mg/kg体重/天，持续4天），小鼠品系（AG129），感染模型同上 阅读提示：Methods：Mouse infection；Figure EV5 legend |