诱导内质网应激
建立内质网应激模型，模拟神经退行性疾病中的蛋白错误折叠状态。
使用300 nM Thapsigargin预处理SH-SY5Y细胞30分钟、1小时或4小时，以阻断SERCA泵，破坏钙稳态，诱导内质网应激。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
人类神经母细胞瘤细胞中诱导的内质网应激可被CFTR矫正剂Lumacaftor逆转
The ER Stress Induced in Human Neuroblastoma Cells Can Be Reverted by Lumacaftor, a CFTR Corrector.
实验完整度
中使用SH-SY5Y细胞模型，通过Western blot、RT-PCR、流式细胞术和钙成像等方法验证了内质网应激、氧化应激和凋亡相关指标，但缺乏体内实验和多层级验证。
主要模型
SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系
重点核对
Thapsigargin预处理浓度和时间：300 nM，30 min、1 h、4 h Lumacaftor给药浓度和时间：2 μM，24 h 细胞培养条件：DMEM/F12培养基，10% FBS，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，37°C，5% CO2 细胞活力检测：MTT法，细胞接种密度4.5×10^3/孔 统计方法：非参数Mann-Whitney U检验，p<0.05被认为显著
摘要
大多数神经退行性疾病具有共同的病因发病机制，即蛋白质聚集体的积累。内质网（ER）内错误折叠蛋白质的积累导致稳态失衡，从而在细胞中引起内质网应激。位于内质网膜上的三种不同蛋白质——IRE1α、PERK和ATF6——控制未折叠蛋白反应（UPR），这是一种为恢复正常生理条件而触发的信号转导途径。内质网腔中错误折叠蛋白质的积累导致GRP78/BiP的转移，从而触发UPR。PERK自身磷酸化导致转录因子ATF4的激活；最后，ATF6激活UPR的靶基因，包括GRP78/Bip。因此，UPR是对内质网应激状态的细胞反应，如果长期不加控制，会导致细胞凋亡和不可逆损伤。Caspase 4的鉴定，它位于内质网，并由网状应激引起的凋亡刺激选择性激活，进一步证明了网状应激与程序性细胞死亡之间的联系。此外，氧化应激与内质网应激相关。氧化应激由线粒体和胞质中不受超氧化物歧化酶酶促调节的活性氧（ROS）水平升高引起，这些酶的活性随应激增加而下降。在此，我们评估了用于囊性纤维化的药物Vx-809（Lumacaftor）在SH-SY5Y神经元细胞中的活性，在这些细胞中，通过Thapsigargin诱导了内质网应激状态，以验证该药物是否能够改善蛋白质折叠，提示其在蛋白质病（如神经退行性疾病（NDs））中的潜在治疗用途。我们的数据表明，Vx-809显著降低了内质网应激下产生的蛋白质水平，特别是通过Western blotting分析检测的Bip、ATF4和ATF6的水平，降低了胞质和线粒体中ROS的水平，并通过流式细胞术分析和恢复钙稳态降低了凋亡通路的激活。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Lumacaftor（Vx-809）能否在人类神经母细胞瘤细胞中逆转由Thapsigargin诱导的内质网应激，并改善蛋白质折叠、降低氧化应激和凋亡？
- 核心机制
- Lumacaftor通过减少未折叠蛋白反应（UPR）关键蛋白（BiP、ATF4、ATF6、p-PERK）的表达，抑制IRE1/XBP1通路，恢复钙稳态，降低ROS水平并增加SODIII表达，从而减轻内质网应激和凋亡。
- 主要证据
- 在SH-SY5Y细胞中，Western blot显示BiP、ATF4、ATF6和p-PERK水平显著降低；RT-PCR显示XBP1剪接减少；FURA 2-AM实验显示钙稳态恢复；流式细胞术显示ROS减少、凋亡（hypodiploid nuclei和caspase 4）降低。
- 研究意义
- 研究表明Lumacaftor可能作为神经退行性疾病（如AD、PD、ALS）的潜在治疗药物，通过修复细胞损伤和恢复神经元稳态来逆转疾病进展。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Lumacaftor处理
评估Lumacaftor对已诱导的内质网应激的干预效果。
在去除Thapsigargin后，向细胞加入含或不含2 μM Lumacaftor的新鲜培养基，处理24小时。
检测UPR通路蛋白表达
分析Lumacaftor对UPR关键蛋白（BiP、ATF4、ATF6、p-PERK）的影响。
通过Western blotting检测细胞裂解物中BiP、ATF4、ATF6、PERK/p-PERK的表达水平，并以actin或tubulin作为内参。
检测XBP1剪接
评估IRE1α通路的激活状态。
通过RT-PCR检测XBP1 mRNA的未剪接（452 bp）和剪接（426 bp）形式。
检测钙信号
评估Lumacaftor对细胞内钙稳态的影响。
使用Fura 2-AM荧光指示剂，在无钙培养基中，通过加入TG（1 nM）或Ionomycin（1 μM）测量内质网钙释放和胞质钙浓度。
检测ROS水平
评估Lumacaftor对胞质和线粒体ROS的影响。
使用H2DCF-DA探针检测胞质ROS，使用MitoSOX Red探针检测线粒体超氧化物，通过流式细胞术测量。
检测凋亡
评估Lumacaftor对内质网应激诱导的凋亡的影响。
通过流式细胞术检测hypodiploid nuclei（亚二倍体核）百分比和caspase 4阳性细胞百分比。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Euroclone | -- |
| 胎牛血清 | Euroclone | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | Lumacaftor (Vx-809) | Selleckchem | S1565 |
| 毒胡萝卜素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Western blot | 抗Grp78/BiP抗体 | Cell Signaling | 3177 |
| 抗ATF6抗体 | Cell Signaling | 658805 | |
| 抗ATF4抗体 | Proteintech | 10835-1-AP | |
| 抗PERK抗体 | Cell Signaling | 3192 | |
| 抗MnSODIII抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-271170 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | OriGene | TA811000 | |
| 抗微管蛋白抗体 | -- | sc-5286 | |
| 抗caspase 4抗体 | -- | sc-1229 | |
| 抗兔二抗 | Bethyl Laboratories | A120-101P | |
| 抗小鼠二抗 | Bethyl Laboratories | A90-137P | |
| 流式分析 | Texas红偶联二抗 | Thermo Fisher Scientific | T6390 |
| ROS检测 | MitoSOX Red线粒体超氧化物指示剂 | Invitrogen | M36008 |
| 细胞活力 | 噻唑蓝四氮唑溴化物 | Sigma-Aldrich | -- |
| ROS检测 | 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 | Sigma-Aldrich | -- |
| 凋亡检测 | 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 钙信号检测 | Fura-2-AM | Sigma-Aldrich | -- |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| RT-PCR | TRI试剂 | Sigma-Aldrich | T9424 |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | -- | K1622 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：SH-SY5Y；培养基：DMEM/F12，10% FBS，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素；培养条件：37°C，5% CO2；传代周期：每周；实验时融合度<80%。 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.2 |
| 药物处理 | Thapsigargin预处理浓度：300 nM；处理时间：30 min、1 h、4 h；Lumacaftor浓度：2 μM；处理时间：24 h。 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.3 |
| 细胞活力检测 | MTT法；细胞密度：4.5×10^3/孔；MTT浓度：5 mg/mL；孵育时间：1 h；阳性对照：Staurosporine 0.2 μM；检测波长：620 nm。 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.4 |
| Western blot | 细胞数：1×10^6/板；裂解液成分；裂解时间30 min；离心：14,000 rpm，15 min，4°C；蛋白定量：Bradford；上样量：60 μg；凝胶浓度：8-10%；转膜；封闭：5%脱脂奶粉，2 h；一抗孵育：4°C过夜；二抗孵育1 h；内参：actin或tubulin。 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.5 |
| RT-PCR | RNA提取：TRI Reagent；逆转录：0.5 μg RNA；cDNA量：2 μL；PCR引物序列：F: 5'-C CTT CTG GGT AGA CCT CTG GGA G-3'，R: 5'-A AAC AGA GTA GCA GCT CAG ACT GC-3'；凝胶：4%琼脂糖，溴化乙锭染色；产物大小：452 bp（未剪接）和426 bp（剪接）。 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.6 |
| 钙信号检测 | 细胞密度：3×10^4/孔；Fura 2-AM浓度：5 μM；孵育时间：45 min；检测：340/380 nm荧光比值；TG刺激浓度：1 nM；Ionomycin浓度：1 μM；缓冲液：无钙HBSS/0.5 mM EGTA。 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.7 |
| ROS检测 | 细胞密度：8×10^4/孔；H2DCF-DA浓度：10 μM，孵育30 min，37°C；MitoSOX Red浓度：2.5 μM，孵育15 min，37°C；检测：流式细胞仪。 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.8 |
| 凋亡检测 | 细胞密度：8×10^4/孔；固定液：2% FBS，4%甲醛，0.1%叠氮钠；透化液：4%甲醛，0.1% Triton X-100，2% FBS，0.1%叠氮钠；caspase 4一抗；Texas-Red二抗；PI浓度：50 μg/mL；检测：流式细胞术。 阅读提示：Materials and Methods, Sections 2.9 and 2.10 |
| 统计分析 | 至少三次独立实验，每次技术重复三次；数据以平均值±标准误表示；使用非参数Mann-Whitney U检验；显著性水平：p<0.05。 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.11 |