细菌制备
为后续感染准备已知浓度的UPEC菌液。
从含卡那霉素的LB平板上挑取单菌落，接种于10 mL含卡那霉素的LB肉汤中，室温静置培养过夜（12-16小时），测量OD600并计算CFU。
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用泌尿道致病性大肠杆菌诱导小鼠单微生物脓毒症的方案
Protocol for inducing monomicrobial sepsis in mice with uropathogenic E. coli.
实验完整度
中该文献为实验方案类文章，详细描述了细菌制备、注射、疾病评分、器官菌载量测定、细胞因子检测和流式细胞术步骤，但未提供具体的功能验证或机制验证实验。
主要模型
C57BL/6Ncr小鼠（8-20周龄，雌性） 分泌RFP的耐卡那霉素的UPEC UTI89菌株
重点核对
细菌制备：LB培养基含卡那霉素50 μg/mL，静置培养12-16小时，OD600在0.6-1.5之间 注射剂量：每只小鼠通过眶后静脉丛注射4×10^7 CFU（200 μL） 感染后监测：在预定时间点（如24小时、2天、3天、4天、5天、7天、10天、14天）进行疾病评分 器官菌载量测定：组织在含0.2% IGEPAL的无菌dH2O中匀浆，稀释后涂布于含卡那霉素的LB琼脂板 流式细胞术：使用特定抗体面板（淋巴细胞和固有细胞）检测免疫细胞亚群
摘要
细菌感染是致病性脓毒症的主要原因。泌尿道致病性大肠杆菌（UPEC）单微生物脓毒症模型是研究宿主对该病原体免疫应答的有用工具。在此，我们提出了一种使用UPEC诱导小鼠单微生物脓毒症的方案。我们描述了制备细菌、将UPEC递送至小鼠以及感染后监测小鼠的步骤。然后，我们详细介绍了测量细胞因子反应和使用流式细胞术检测免疫细胞亚群的程序。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何建立一种可重复的UPEC诱导的小鼠单微生物脓毒症模型，以研究宿主对该病原体的免疫应答？
- 核心机制
- 文中未明确说明。
- 主要证据
- 该方案提供了详细的步骤，包括细菌制备、静脉注射、疾病严重程度评估、器官病原体负荷定量、细胞因子测量和免疫细胞亚群检测，并预期使用所列感染剂量在第3天达到约80%的死亡率。
- 研究意义
- 该模型被视为研究宿主对系统性革兰氏阴性菌感染固有免疫应答的有用工具，并为将研究从实验室转化到临床提供支持。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细菌递送
通过静脉注射将UPEC引入小鼠体内以诱导脓毒症。
小鼠麻醉后，通过眶后静脉丛注射200 μL含4×10^7 CFU的细菌悬液。
疾病严重程度评估
监测感染后小鼠的临床状态和疾病进展。
在预定时间点评估 grooming、mobility、body position 和体重变化，并给予评分。
器官病原体负荷定量
测定感染后不同器官中的细菌数量，以评估免疫控制能力。
收集血液和器官（脾、肝、肾），在含0.2% IGEPAL的无菌dH2O中处理，稀释后涂布于含卡那霉素的LB琼脂板，计数菌落。
细胞因子反应测量
检测感染后血清细胞因子水平，评估系统性炎症反应。
收集血液，凝固后离心取血清，使用细胞计数珠阵列检测细胞因子/趋化因子。
免疫细胞亚群检测
通过流式细胞术量化外周血和脾脏中免疫细胞亚群的变化。
收集血液和脾脏，制备单细胞悬液，裂解红细胞，染色并上机检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
动物感染模型
病原体负荷分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | Miller LB琼脂 | -- | -- |
| Miller LB肉汤 | -- | -- | |
| 卡那霉素 | Gold Bio | Cat# K-120-5 | |
| Parafilm封口膜 | Sigma | Cat# P7793 | |
| 分光光度计 | Thermo Scientific Spectronic 20D+ | Cat# 333183000 | |
| 动物感染 | 胰岛素注射器29Gx1/2" | -- | -- |
| 盐酸丙美卡因滴眼液 | Bernell | Cat# AK2D15DS | |
| 病原体负荷分析 | IGEPAL | Sigma | Cat# 542334 |
| gentleMACS C管 | Miltenyi | -- | |
| gentleMACS解离器 | Miltenyi | -- | |
| 细胞因子测量 | Eppendorf管 | -- | -- |
| 细胞计数珠阵列 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | Ghost dye 510活力染料 | Cell Signaling Technology | Cat# 59863 |
| FACS缓冲液 | -- | -- | |
| Fc阻断溶液 | -- | -- | |
| 抗小鼠CD3抗体 (145-2C11, PerCP-Cy5.5) | BioLegend | Cat# 100328 | |
| 抗小鼠CD4抗体 (GK1.5, AF700) | BioLegend | Cat# 100430 | |
| 抗小鼠CD8a抗体 (53-6.7, BV605) | BioLegend | Cat# 100744 | |
| 抗小鼠CD11a抗体 (M17/4, FITC) | BioLegend | Cat# 101106 | |
| 抗小鼠CD11b抗体 (M1/70, BV421) | BioLegend | Cat# 101236 | |
| 抗小鼠CD16/32抗体 (93) | BioLegend | Cat# 101301 | |
| 抗小鼠CD19抗体 (6D5, BV711) | BioLegend | Cat# 115555 | |
| 抗小鼠CD49d抗体 (R1-2, PE) | BioLegend | Cat# 103608 | |
| 抗小鼠CD115抗体 (AFS98, PE) | BioLegend | Cat# 135506 | |
| 抗小鼠Ly6G抗体 (1A8, FITC) | BioLegend | Cat# 127606 | |
| 抗小鼠NK1.1抗体 (SI7016D, PE-Fire 700) | BioLegend | Cat# 156528 | |
| 补偿微球 | BioLegend | Cat# 424602 | |
| ACK裂解液 | Thermo Fisher Scientific | Cat# A1049201 | |
| 血液收集 | 肝素钠抗凝剂 | Fresenius Kabi | Cat# 504036 |
| 10× EDTA抗凝剂 | Elabscience | Cat# E-EL-SR003 | |
| 流式细胞术 | 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 |
| 细胞培养 | 青霉素-链霉素 | HyClone | Cat# SV30010 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌制备与定量 | LB培养基中卡那霉素浓度，培养温度和时间，OD600与CFU换算公式，细菌重悬体积 阅读提示：Before you begin 和 Preparation of bacteria prior to infection 部分 |
| 动物感染 | 小鼠品系、年龄、性别，麻醉方式，注射途径，感染剂量（CFU/只） 阅读提示：Delivering the bacteria to mice 部分 |
| 疾病严重程度评估 | 评分标准（ grooming、mobility、body position、体重），评分时间点 阅读提示：Evaluating disease severity 部分 |
| 病原体负荷分析 | 组织匀浆液成分，解离程序，稀释倍数，涂板体积，孵育温度和时长，计数标准 阅读提示：Determining pathogen burden in organs 部分 |
| 细胞因子测量 | 采血时间点和体积，血清制备方法，检测方法（CBA）及试剂盒 阅读提示：Measurement of cytokine response 部分 |
| 免疫细胞亚群检测 | 抗凝剂选择，红细胞裂解条件，细胞数量，抗体面板和稀释度，染色时间，流式细胞仪类型 阅读提示：Detection of immune cell subsets using flow cytometry 部分和图2 |