建立肝内转移BALB/c小鼠模型
建立模拟肝癌肝内转移的动物模型，用于评估SSPH Ⅰ的抗转移作用。
将人肝癌HepG2细胞接种至BALB/c裸鼠肝脏，建立原位肝细胞癌异种移植模型。
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水田七（车前叶裂果薯）皂苷Ⅰ通过负调控转化生长因子-β1/Smad7网络和上皮-间质转化抑制肝内转移BALB/c小鼠模型的转移
Saponin Ⅰ from Shuitianqi () inhibits metastasis by negatively regulating the transforming growth factor-β1/Smad7 network and epithelial-mesenchymal transition in the intrahepatic metastasis Bagg's Albino/c mouse model.
实验完整度
中文献包含体内动物模型（肝内转移BALB/c小鼠模型）及分子生物学检测（Western blot、ELISA、免疫组化），并进行了功能验证（转移抑制），但未包含体外细胞功能实验或机制验证。
主要模型
肝内转移BALB/c小鼠模型（HepG2细胞原位接种）
重点核对
SSPH Ⅰ给药剂量：25、50、75 mg/kg，每日1次，口服灌胃 顺铂给药剂量：2 mg/kg，每2日1次，腹腔注射 实验周期：肿瘤接种后2周开始给药，持续2周 动物分组：模型组、顺铂组、SSPH Ⅰ 25/50/75 mg/kg组，每组6只 检测指标：肝组织病理（HE染色）、TGF-β1/Smad7、EMT、MMPs、血管生成相关蛋白表达
摘要
目的：探讨水田七（车前叶裂果薯）皂苷Ⅰ（SSPH Ⅰ）对肝细胞癌（HCC）转移的影响，并阐明其潜在机制。方法：采用人肝癌细胞（HepG2）建立肝内转移BALB/c小鼠模型，然后分别给予生理盐水（每日1次）、顺铂（2 mg/kg，每2日1次）和SSPH Ⅰ（25、50和75 mg/kg，每日1次）处理。随后，我们使用一系列分子生物学技术评估了肝内转移BALB/c小鼠模型中肝脏病理学和靶蛋白表达的变化。结果：基于我们的分析，SSPH Ⅰ显著减轻了肝细胞坏死和肿瘤细胞浸润。此外，SSPH Ⅰ通过降低基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9、CD31、CD34和血管内皮生长因子（VEGF）水平，抑制了细胞外基质（ECM）降解和血管生成。此外，SSPH Ⅰ通过抑制转化生长因子-β1（TGF-β1）/Smad7轴和上皮-间质转化（EMT）来抑制侵袭和转移，表现为TGF-β1、N-钙黏蛋白和波形蛋白表达减少，而Smad7和E-钙黏蛋白表达升高。结论：SSPH Ⅰ介导的TGF-β1/Smad7轴和EMT的负调控对于抑制HCC侵袭和转移至关重要。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 水田七皂苷Ⅰ（SSPH Ⅰ）是否影响肝细胞癌（HCC）的转移，以及其潜在的作用机制是什么？
- 核心机制
- SSPH Ⅰ通过负调控TGF-β1/Smad7网络并抑制上皮-间质转化（EMT），从而抑制HCC的侵袭和转移。
- 主要证据
- 在肝内转移BALB/c小鼠模型中，SSPH Ⅰ减轻了肝细胞坏死和肿瘤浸润，降低了TGF-β1、N-钙黏蛋白、波形蛋白、MMP-2、MMP-9、CD31、CD34和VEGF的表达，同时升高了Smad7和E-钙黏蛋白的表达。
- 研究意义
- SSPH Ⅰ作为一种新型甾体皂苷，是抑制EMT和TGF-β1/Smad7网络的有前景的靶向药物，为HCC治疗提供了更多选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SSPH Ⅰ和顺铂处理
评估不同剂量SSPH Ⅰ的抗肿瘤转移作用，并与顺铂进行比较。
模型小鼠分为5组，分别口服生理盐水、SSPH Ⅰ（25、50、75 mg/kg/日）或腹腔注射顺铂（2 mg/kg/每2日），持续2周。
评估肿瘤转移和肝脏病理
观察SSPH Ⅰ对肿瘤远处转移和肝脏组织病理变化的影响。
处死小鼠后，记录脾脏和腹腔转移情况，并通过HE染色观察肝组织病理变化。
检测TGF-β1/Smad7信号通路蛋白表达
验证SSPH Ⅰ是否通过负调控TGF-β1/Smad7通路发挥抗转移作用。
通过Western blot、ELISA和免疫组化检测肝组织和血清中TGF-β1和Smad7蛋白的表达水平。
检测上皮-间质转化（EMT）标志物
验证SSPH Ⅰ是否通过抑制EMT来抑制HCC转移。
通过Western blot和免疫组化检测E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达。
检测细胞外基质（ECM）降解和血管生成相关蛋白
验证SSPH Ⅰ是否通过抑制ECM降解和血管生成来抑制转移。
通过Western blot、ELISA和免疫组化检测MMP-2、MMP-9、CD31、CD34和VEGF的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良 eagle 培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | GeminiBio | 900-108 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Solarbio | P1400-100 | |
| CO2 培养箱 | Thermo Fisher Scientific | 311 | |
| 药物处理 | 顺铂 | Shandong Qilu Pharmaceutical Group Co., Ltd. | 10030052 |
| ELISA | TGF-β1 ELISA 试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | E-EL-M0051c |
| MMP-2 ELISA 试剂盒 | Jiangsu Enzyme Link Biotechnology Co., Ltd. | MMP-2-201906 | |
| MMP-9 ELISA 试剂盒 | Jiangsu Enzyme Link Biotechnology Co., Ltd. | MMP-9-201906 | |
| VEGF ELISA 试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | E-EL-M1292c | |
| Western blot | BCA 蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0012S |
| β-肌动蛋白抗体 | CST | 4970 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | CST | 3195S | |
| N-钙黏蛋白抗体 | CST | 13116S | |
| 波形蛋白抗体 | CST | 5741T | |
| TGF-β1 抗体 | CST | 3711S | |
| Smad7 抗体 | PTG | 25840-1-AP | |
| MMP-2 抗体 | CST | 40994S | |
| MMP-9 抗体 | PTG | 10375-2-AP | |
| CD31 抗体 | PTG | 28083-1-AP | |
| CD34 抗体 | CST | 26233S | |
| VEGF 抗体 | PTG | 19003-1-AP | |
| 山羊抗兔 IgG 二抗 | Abcam | ab97051 | |
| Odyssey CLx 成像系统 | LI-COR Biosciences | -- | |
| 免疫组化 | TGF-β1 抗体 | PTG | 21898-1-AP |
| CD34 抗体 | Sino Biological Inc. | 50589-T24 | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 5.0 软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 动物品系：BALB/c裸鼠，雄性，4周龄，体重17-22 g；细胞系：HepG2；接种方式：原位接种至肝脏；接种后给药时间：2周 阅读提示：Materials and Methods 2.2 Animals, 2.3 HepG2 cells culture, 2.4 Intrahepatic metastasis BALB/c mouse model establishment |
| 药物处理 | SSPH Ⅰ剂量：25、50、75 mg/kg，每日1次，口服；顺铂剂量：2 mg/kg，每2日1次，腹腔注射；给药周期：2周；分组：模型组、顺铂组、SSPH Ⅰ 3个剂量组，每组6只 阅读提示：Materials and Methods 2.4 Drug treatment |
| Western blot | 抗体稀释比例及货号：β-actin (1:1000, CST 4970), E-cadherin (1:1000, CST 3195S), N-cadherin (1:1000, CST 13116S), Vimentin (1:1000, CST 5741T), TGF-β1 (1:1000, CST 3711S), Smad7 (1:500, PTG 25840-1-AP), MMP-2 (1:500, CST 40994S), MMP-9 (1:500, PTG 10375-2-AP), CD31 (1:500, PTG 28083-1-AP), CD34 (1:500, CST 26233S), VEGF (1:200, PTG 19003-1-AP) 阅读提示：Materials and Methods 2.7 Western blotting |
| ELISA | 检测指标：TGF-β1, MMP-2, MMP-9, VEGF；试剂盒：TGF-β1 (Elabscience E-EL-M0051c), MMP-2 (Jiangsu Enzyme Link MMP-2-201906), MMP-9 (Jiangsu Enzyme Link MMP-9-201906), VEGF (Elabscience E-EL-M1292c) 阅读提示：Materials and Methods 2.6 Enzyme-linked immunosorbent assay |
| 免疫组化 | 固定：4%多聚甲醛24小时；切片厚度：5 μm；抗原修复：10 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）10分钟；封闭：5% BSA 1小时；一抗稀释比例：1:200；二抗：山羊抗兔IgG (Abcam ab97051) 30分钟；DAB显色1分钟 阅读提示：Materials and Methods 2.8 Immunohistochemistry |