构建CTX代谢细胞模型
使LLC细胞表达CYP2B6以代谢CTX为活性形式，用于体外评估CTX的细胞毒性。
对LLC细胞进行CYP2B6恒定表达质粒转染，并通过Q-PCR和Western blot验证CYP2B6的过表达，同时检测不同细胞系中P450表达水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
小白菊内酯通过抑制NF-kB信号通路增强环磷酰胺在肺癌中的节拍化疗效果
Parthenolide enhances the metronomic chemotherapy effect of cyclophosphamide in lung cancer by inhibiting the NF-kB signaling pathway.
实验完整度
高包含体外细胞实验（CCK8、凋亡检测）、体内荷瘤小鼠模型（生存分析、肿瘤生长监测）及免疫组化、Western blot等分子机制验证，且明确功能验证和机制验证。
主要模型
P450过表达LLC细胞系（小鼠Lewis肺癌细胞） C57BL/6J小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
LLC细胞转染CYP2B6恒定表达质粒 细胞增殖实验：2×10^3细胞/孔接种96孔板，处理48小时 凋亡检测：5×10^4细胞，Annexin V-FITC和PI双染 动物实验：2×10^6细胞/只皮下接种，每组10只小鼠 给药剂量：CTX 20 mg/kg/day，PTL 40 mg/kg/day，灌胃给药持续约3周
摘要
背景：小白菊内酯（PTL），一种来源于药用植物小白菊的倍半萜内酯，通过靶向NF-kB、STAT3等通路表现出多种生物效应，已成为多种恶性肿瘤的有前景的辅助治疗药物。目的：评估PTL对环磷酰胺（CTX）节拍化疗的体外和体内效果。方法：通过测量细胞活力和凋亡来评估PTL和CTX对Lewis肺癌细胞（LLC细胞）的细胞毒性。使用肿瘤异种移植小鼠模型评估抗肿瘤效果，并监测小鼠的生存率和肿瘤体积。此外，收集的肿瘤组织分析了肿瘤微环境指标和炎症因子。结果：在体外，PTL与CTX在抑制LLC细胞生长和促进凋亡方面表现出协同作用。在体内，PTL与CTX联合的节拍化疗提高了荷瘤小鼠的生存率，并降低了肿瘤生长速度。此外，PTL与CTX联合的节拍化疗减少了NF-κB活化，并通过减少肿瘤血管生成、转化生长因子β和α-SMA阳性细胞来改善肿瘤免疫微环境。结论：PTL是一种有效的化合物，在体外和体内均能增强CTX的节拍化疗效果，提示其作为节拍化疗的辅助治疗策略以改善化疗效果的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PTL能否通过抑制NF-κB信号通路增强CTX在肺癌中的节拍化疗效果。
- 核心机制
- PTL通过抑制CTX诱导的NF-κB激活（降低p65磷酸化和转录活性），联合CTX抑制肿瘤生长、减少血管生成和降低TGF-β及α-SMA表达，从而增强CTX的抗肿瘤效果。
- 主要证据
- 体外实验中PTL与CTX联用协同抑制P450过表达LLC细胞增殖并促进凋亡；体内实验中联合治疗显著提高荷瘤小鼠生存率、降低肿瘤生长速率，并减少肿瘤血管密度（CD31阳性）和TGF-β、α-SMA阳性细胞。
- 研究意义
- PTL可能作为节拍化疗的辅助治疗策略，提高化疗效果，有助于科学家和临床医生制定新的节拍化疗方案。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞毒性及协同效应评估
评估PTL和CTX单用及联用对P450过表达LLC细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用，并计算协同指数。
使用CCK8法检测不同浓度CTX和PTL处理后的细胞活力，使用PI/Annexin V双染流式细胞术检测凋亡，并使用CompuSyn软件计算联合指数。
体内抗肿瘤效果评估
在皮下移植瘤小鼠模型中评估PTL联合低剂量CTX节拍化疗对小鼠生存和肿瘤生长的影响。
建立C57BL/6J小鼠皮下移植瘤模型，随机分为对照组、CTX、PTL和CTX+PTL组，每日灌胃给药，记录小鼠生存和肿瘤大小。
肿瘤组织病理及微环境分析
分析联合治疗对肿瘤组织形态、血管生成、巨噬细胞浸润和免疫调节因子的影响。
对肿瘤组织进行HE染色、CD31、F4/80、CD206、TGF-β、IL-6、TNF-α和α-SMA的免疫组化染色，并统计阳性细胞比例。
NF-κB信号通路验证
验证PTL联合CTX是否抑制CTX诱导的NF-κB激活。
通过Western blot检测NF-κB p65及磷酸化水平，通过NF-κB p65转录因子活性检测试剂盒分析转录活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
评估体内效果
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养和增殖检测 | RPMI-1640培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| 胎牛血清 | 文中未明确说明 | -- | |
| 细胞增殖检测 | 增强型CCK8细胞增殖检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| 细胞凋亡检测 | 细胞凋亡检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| Annexin V-FITC | 文中未明确说明 | -- | |
| 碘化丙啶 | 文中未明确说明 | -- | |
| 流式分析 | 流式细胞仪 | BD Bioscience | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| CYP2B6抗体 | ABclonal | A1463 | |
| 抗NF-kB P65抗体 | Abcam | ab16502 | |
| 抗NF-kB p65磷酸化(S536)抗体 | Abcam | ab76302 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Elabscience | E-AB-20034 | |
| 山羊抗兔IgG（H+L）（过氧化物酶/HRP偶联） | Elabscience | E-AB-1003 | |
| Immobilon Western HRP底物 | Millipore | -- | |
| 化学发光成像仪 | Tanon | -- | |
| NF-κB活性检测 | NF-κB p65转录因子活性检测试剂盒 | RayBiotech Inc. | -- |
| 核/胞质蛋白提取试剂盒 | Viagene Biotech Inc. | SINP001 | |
| 动物实验 | IV型胶原酶 | Sigma | -- |
| 免疫组化 | 抗CD31抗体 | Abcam | ab124432 |
| 抗F4/80抗体 | ABclonal | A1256 | |
| 抗α平滑肌肌动蛋白[1A4]抗体 | Abcam | ab7817 | |
| 抗甘露糖受体/CD206抗体 | Abcam | ab64693 | |
| 抗转化生长因子β（TGF β1）抗体 | Abcam | ab215715 | |
| 肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体 | ABclonal | A11534 | |
| IL-6抗体 | ABclonal | A0286 | |
| 山羊抗小鼠IgG（H+L）（过氧化物酶/HRP偶联） | Elabscience | E-AB-1001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外细胞模型 | LLC细胞是否稳定表达CYP2B6，培养基成分（RPMI-1640+10%FBS），孵育条件（37℃、5%CO2），细胞生长状态。 阅读提示：Materials and Methods: Cell line and mice, Cell proliferation assay |
| 药物处理与剂量 | CTX和PTL的具体浓度、处理时间（48小时）、联合指数计算方法。 阅读提示：Results: PTL enhanced cytotoxicity of CTX on P450 overexpressed LLC cells; Figure 2 |
| 动物模型建立 | 小鼠品系、体重、细胞接种数量、接种部位、分组方法（每组10只）。 阅读提示：Materials and Methods: Subcutaneous tumor inoculation |
| 节拍化疗方案 | CTX剂量（20 mg/kg/day）、PTL剂量（40 mg/kg/day）、给药方式（灌胃）、给药频率（每日）和持续时间（约3周）。 阅读提示：Materials and Methods: Subcutaneous tumor inoculation; Results: PTL improved survival... |
| 数据收集与统计分析 | 生存记录标准（肿瘤长径达2cm处死）、肿瘤测量方法、统计分析选择（Kaplan-Meier、log-rank、ANOVA、t检验）。 阅读提示：Materials and Methods: Statistical analysis; Figure 3 |