三部分基序(TRIM)家族的分子特征研究及TRIM31在胃癌中的初步验证

An investigation of the molecular characterization of the tripartite motif (TRIM) family and primary validation of TRIM31 in gastric cancer.

作者信息Yixin Ding, Yangyang Lu, Jing Guo, Shuming Chen, Xiaoxi Han, Shibo Wang, Mengqi Zhang, Rui Wang, Jialin Song, Kongjia Wang, Wensheng Qiu, Weiwei Qi
PMID38978046
发布时间2024-07-09
DOI10.1186/s40246-024-00631-7

实验完整度

包含生物信息学分析、体外细胞实验和组织芯片免疫组化验证,但缺乏动物实验和深入的机制研究。

主要模型

胃癌细胞系AGS 胃上皮细胞系GES-1 胃癌组织微阵列芯片

重点核对

TRIM31敲低效率(TRIM31-sh3) 细胞增殖能力(MTT和EdU实验) 细胞迁移能力(划痕实验) 氧化应激水平(ROS检测) 线粒体膜电位(JC-1染色)

摘要

大多数以E3泛素连接酶为特征的TRIM家族成员参与泛素化和肿瘤发生。然而,目前缺乏对该家族在胃癌(GC)中的全面研究。通过结合TCGA和GEO数据库,获得常见的TRIM家族成员(TRIMs),以研究基因表达、基因突变和临床预后。基于TRIMs,进行了共识聚类分析,并开发了风险评估系统和预后模型。特别地,选择具有临床预后和诊断价值的TRIM31进行单基因生物信息学分析、体外实验验证和临床组织微阵列的免疫组织化学分析。合并数据集包含66个TRIMs,其中52个差异表达,43个差异预后。通过共识聚类分析获得的基因簇之间存在显著的生存差异。使用通过多变量Cox回归和LASSO回归鉴定的4个差异表达基因,开发了风险评分系统。较高的风险评分与较差的预后、抑制性免疫细胞浸润和药物耐药性相关。转录组数据和临床样本组织微阵列证实TRIM31在GC中高表达,并与不良预后相关。通路富集分析、细胞迁移和集落形成实验、EdU实验、活性氧(ROS)实验和线粒体膜电位实验揭示,TRIM31可能与细胞周期调控和氧化应激相关通路有关,有助于胃癌发生。本研究调查了TRIM家族在GC中的整体功能和表达谱以及基于该家族的风险评分系统。围绕TRIM31的进一步研究为理解其家族其他成员在GC中的潜在作用机制提供了见解。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
TRIM家族在胃癌中的表达、预后价值及TRIM31的功能作用是什么?
核心机制
TRIM31可能通过调控细胞周期和氧化应激相关通路促进胃癌发生。
主要证据
TCGA和GEO数据分析显示TRIM31在胃癌中高表达且与不良预后相关;体外实验表明敲低TRIM31抑制细胞增殖、迁移,增加ROS水平,降低线粒体膜电位,并下调CyclinD1和CDK2表达。
研究意义
TRIM31可能作为胃癌的预后生物标志物和化疗敏感性预测指标,并为TRIM家族其他成员在胃癌中的作用机制提供见解。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

TRIM家族表达和预后分析

评估TRIM家族成员在胃癌中的表达差异和预后相关性。

整合TCGA-STAD和GSE84437转录组数据,分析TRIMs的表达、差异表达和生存分析。

2

共识聚类和风险模型构建

基于TRIMs表达对胃癌样本进行分子分型并构建预后风险模型。

使用共识聚类将样本分为不同基因簇,通过LASSO和多因素Cox回归筛选hub基因并计算风险评分。

3

TRIM31单基因生物信息学分析

分析TRIM31在胃癌中的表达、预后、通路富集及药物敏感性。

基于TCGA数据比较TRIM31在癌与正常组织中的表达,进行K-M生存分析、GSEA富集分析和药物IC50预测。

4

TRIM31体外功能验证

验证TRIM31对胃癌细胞增殖、迁移、氧化应激和线粒体功能的影响。

在AGS细胞中敲低TRIM31,进行MTT、EdU、划痕、ROS、JC-1和Western blot实验。

5

组织芯片免疫组化验证

在临床样本中验证TRIM31的表达及其与预后的关系。

对97例胃癌和83例癌旁组织芯片进行TRIM31免疫组化染色,分析其表达差异及与生存的关系。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
RPMI 1640培养基----
胎牛血清----
青霉素/链霉素----
慢病毒(GV112)Jikai Gene--
MTTAladdinM158055
二甲基亚砜----
全功能微孔板检测仪BioTek--
BeyoClick EdU-488细胞增殖检测试剂盒BeyotimeC0071S
Hoechst 33342----
倒置荧光显微镜Nikon--
结晶紫AladdinC110703
H2DCFDASigma-AldrichD6883
线粒体膜电位检测试剂盒Elabscience Biotechnology Co.,LtdE-CK-A301
Western/IP裂解液BeyotimeP0013
PVDF膜----
HRP山羊抗兔IgG(H+L)AbclonalAS014
抗细胞周期蛋白D1抗体AbclonalA19038
抗CDK2抗体AbclonalA0094
抗GAPDH抗体Cell Signaling Technology#5174
电化学发光检测试剂盒----
单克隆兔抗人TRIM31抗体Proteintech--
组织微阵列芯片Shanghai Qutdo Biotech Company--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养和慢病毒感染
细胞系来源、培养基成分、慢病毒载体和靶序列、MOI、感染时间、嘌呤霉素筛选浓度和时间
阅读提示:Methods: Cell culture and reagents; Establishment of the stable transfected cell line
细胞增殖和活力检测
细胞接种密度、MTT浓度、孵育时间、检测波长、EdU孵育时间
阅读提示:Methods: Cell viability determination; EdU assay
迁移和集落形成实验
划痕实验细胞密度、划痕后培养时间;集落形成实验细胞数、培养时间、结晶紫浓度
阅读提示:Methods: Migration and colony formation assay
ROS和线粒体膜电位检测
H2DCFDA浓度、孵育时间;JC-1染色步骤
阅读提示:Methods: ROS assay and measurement of mitochondrial membrane potential
Western blot
裂解液、离心条件、抗体稀释度、封闭时间
阅读提示:Methods: Western blot
免疫组织化学
组织芯片样本数量、抗体稀释度、IHC评分方法
阅读提示:Methods: Tissue microarray chips and immunohistochemistry (IHC) staining