构建CRISPR/Cas9筛选体系
建立全基因组筛选平台以鉴定调控全能性的基因。
构建OG2CT报告细胞系（OCT4-GFP和MERVL-tdTomato），设计piggyBac sgRNA文库（覆盖13,000个sgRNA），共转染Cas9质粒和sgRNA文库，经Neo筛选和扩大培养至3×10^8细胞。
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胚胎干细胞中的CRISPR/Cas9筛选揭示Mdm2调控全能性退出
A CRISPR/Cas9 screen in embryonic stem cells reveals that Mdm2 regulates totipotency exit.
实验完整度
高包括全基因组CRISPR筛选、候选基因验证、RNA-seq、细胞周期分析、Co-IP、CUT&Tag、胚胎发育实验等多层级验证。
主要模型
小鼠胚胎干细胞（mESCs） OG2CT报告细胞系 小鼠胚胎 猪胚胎
重点核对
Mdm2敲低（KD）或敲除对2CLC比例的影响 Mdm2过表达对2C基因表达的影响 Nutlin-3处理浓度及对细胞周期和2CLC比例的影响 Mdm2与PRC2的相互作用（Co-IP） Mdm2对Dux位点H3K27me3修饰的影响
摘要
在早期胚胎发育过程中，从全能性到多能性的转变是正常发育的一个基本且关键的过程。然而，调控这一转变的机制仍然难以捉摸。在此，我们进行了一项全面的全基因组CRISPR/Cas9筛选，以研究小鼠胚胎干细胞（mESCs）中的2细胞样细胞（2CLCs）表型。这项工作鉴定出十个在这一转变过程中决定细胞命运的关键调控因子。值得注意的是，我们的研究揭示Mdm2是2CLCs的一个重要负调控因子，因为Mdm2的扰动导致2CLCs比例升高。Mdm2似乎通过影响细胞周期进程和H3K27me3表观遗传修饰来影响细胞命运。总之，我们的CRISPR/Cas9筛选结果揭示了一些在不同水平上调控全能性和多能性的具有不同功能的基因，为未来分子研究提供了潜在的靶点资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哪些基因调控小鼠胚胎干细胞从全能性向多能性的转变，以及Mdm2在这一过程中的作用机制是什么？
- 核心机制
- Mdm2通过缩短G1期促进多能性状态，并通过与PRC2相互作用增强Dux位点的H3K27me3修饰，从而抑制2C基因表达，促进全能性退出。
- 主要证据
- 全基因组CRISPR筛选鉴定出10个候选基因，包括Mdm2；Mdm2 KD增加2CLC比例，过表达抑制2C基因；Co-IP显示MDM2与SUZ12相互作用；CUT&Tag显示Mdm2影响Dux位点H3K27me3水平；细胞周期分析显示Mdm2影响G1期。
- 研究意义
- 研究揭示了Mdm2在调控全能性退出中的重要作用，为理解早期胚胎发育和细胞命运决定提供了新见解，并为未来分子研究提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选和鉴定候选基因
鉴定负调控全能性的基因。
将突变细胞池分为三组，FACS分选tdTomato+细胞，提取基因组DNA进行深度测序，使用MAGeCK算法分析sgRNA富集，结合通路分析选择18个候选基因进行验证。
候选基因的功能验证
验证候选基因对2CLC比例和基因表达的影响。
构建CRISPR KO细胞系，通过FACS检测2CLC比例，RT-qPCR检测2C基因和全能性基因表达。
Mdm2功能研究
深入探究Mdm2在调控全能性退出中的作用。
构建Mdm2 KD和OE细胞系，通过Western blot验证敲低效率，FACS检测2CLC比例随时间变化，RNA-seq分析转录组，嵌合体实验评估发育潜能，细胞周期分析，CUT&Tag检测H3K27me3修饰，Co-IP检测与PRC2相互作用。
胚胎发育验证
验证Mdm2在早期胚胎发育中的作用。
用Nutlin-3处理小鼠和猪受精卵，观察胚胎发育情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 10829018 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15104122 | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | 11140050 | |
| 谷氨酰胺补充剂 | Gibco | 35050079 | |
| 小鼠白血病抑制因子 | Millipore | ESG1106 | |
| β-巯基乙醇 | Gibco | 15104122 | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| CRISPR筛选 | G418 | InvivoGen | ant-gn-5 |
| PCR扩增 | Gotaq DNA聚合酶 | Mei5bio | MF002 |
| RNA提取和qPCR | RaPure总RNA提取试剂盒 | Magene | R4011 |
| ABScript III逆转录预混液 | Abclonal | RK20429 | |
| 2x RealStar Green PCR预混液 | Genestar | A311-10 | |
| 免疫共沉淀 | 免疫沉淀裂解液 | Beyotime | P0037 |
| Pierce磁珠 | Thermo Scientific | 88802 | |
| FLAG抗体 | Sigma | F1804 | |
| HA抗体 | Beyotime | AH158 | |
| IgG抗体 | Beyotime | A7028 | |
| 蛋白质印迹 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 |
| MDM2抗体 | Abcam | ab259265 | |
| SUZ12抗体 | Cell Signal Technology | 3737 | |
| 肌动蛋白抗体 | Beyotime | AA128 | |
| 微管蛋白抗体 | Beyotime | AF2835 | |
| 组蛋白H3抗体 | Elabscience | E-AB-22003 | |
| H3K27me3抗体 | Sigma | 07-449 | |
| 免疫荧光 | CDX2一抗 | Biogenex | MU392A |
| 二抗 | Invitrogen | A32723 | |
| DAPI | Beyotime | P0131 | |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| 药物处理 | Nutlin-3 | Selleck | S1061 |
| CUT&Tag | NovoNGS CUT&Tag 3.0高灵敏度试剂盒 | Novoprotein | N259 |
| FLAG抗体 | Sigma | F1804 | |
| H3K27me3抗体 | Sigma | 07-449 | |
| 设备 | FACS Calibur流式细胞仪 | BD | -- |
| HiSeq TM4000测序仪 | Illumina | -- | |
| NovaSeq PE150测序仪 | Illumina | -- | |
| Lonza 2B核转染系统 | Lonza | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 培养基成分、血清浓度、LIF浓度、饲养层细胞处理 阅读提示：Materials and methods: Cell culture |
| CRISPR筛选 | sgRNA文库覆盖度、筛选细胞数量、筛选轮数、测序深度 阅读提示：Materials and methods: Genome-wide CRISPR KO screens |
| 候选基因验证 | sgRNA序列、转染方法、筛选药物浓度、敲除效率验证 阅读提示：Materials and methods: Generation of CRISPR KO cells |
| Mdm2功能研究 | Mdm2 KD和OE细胞系构建方法、FACS检测时间点、RNA-seq分析参数 阅读提示：Materials and methods: Overexpression of MDM2 in mESCs, RNA sequencing and bioinformatics analysis |
| 胚胎发育实验 | Nutlin-3浓度、胚胎培养条件、观察时间点 阅读提示：Materials and methods: Nutlin-3 treatment |