构建体内AS模型并检测STX17表达
验证STX17在AS中的表达变化
使用6周龄ApoE KO小鼠（n=8）喂食高脂饮食12周建立AS模型，对照组为喂食普通饮食的ApoE KO小鼠和C57BL/6J小鼠。通过血脂检测、HE染色、Masson染色和油红O染色评估模型构建，并通过Western blot检测主动脉血管中STX17表达。
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STX17敲低加剧动脉粥样硬化：揭示自噬和炎症的作用
Exacerbation of atherosclerosis by STX17 knockdown: Unravelling the role of autophagy and inflammation.
实验完整度
中研究包含体内动物模型和体外细胞模型，并进行了功能验证（迁移、成管）和机制验证（自噬流、炎症、STING），但分子机制探索仅在体外进行，缺乏体内敲除验证。
主要模型
ApoE敲除（KO）小鼠高脂饮食模型 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）ox-LDL处理模型
重点核对
动物模型：6周龄ApoE KO小鼠，Western diet喂养12周 细胞模型：HUVECs，ox-LDL处理浓度100 μg/mL，时间48 h STX17敲低：shRNA-STX17慢病毒，MOI=10-30 STING敲低：siRNA，浓度50 nM，转染6 h 自噬流检测：mRFP-GFP-LC3腺病毒，MOI=500
摘要
Syntaxin 17 (STX17)已被确定为介导自噬体与溶酶体融合的关键因子。然而，其在动脉粥样硬化（AS）中的具体作用仍不清楚。本研究旨在阐明STX17在AS发生和发展中的作用及机制贡献。利用体内和体外AS模型系统，我们采用高脂饮食喂养的ApoE敲除（KO）小鼠和氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）处理的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）来评估STX17的表达。为了研究潜在机制，我们使用shRNA-STX17慢病毒敲低STX17表达，随后评估HUVECs中的自噬和炎症。在体内和体外AS模型中，STX17表达显著上调。敲低STX17加重了HUVEC损伤，无论有无ox-LDL处理。此外，我们观察到STX17敲低损害自噬体降解，阻碍自噬流，并导致HUVECs中功能失调的溶酶体积累。此外，STX17敲低增强了ox-LDL处理后HUVECs的炎症反应。进一步的机制探索揭示了STX17与STING之间的关联；降低STX17表达会增加STING水平。进一步敲低STING增强了自噬流。总之，我们的研究结果表明，STX17敲低通过阻碍自噬流和放大炎症反应加剧AS。此外，STX17与STING之间的相互作用可能在STX17介导的自噬中发挥关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- STX17在动脉粥样硬化发生发展中的作用及其与STING的相互作用是否调控自噬和炎症？
- 核心机制
- STX17敲低通过阻碍自噬流和加剧炎症反应加重AS。STX17与STING相互作用，STX17敲低导致STING表达增加，STING敲低可恢复自噬流，提示STING可能通过结合STX17调节自噬。
- 主要证据
- 在ApoE KO小鼠AS模型和ox-LDL处理的HUVECs中，STX17表达上调；STX17敲低损害HUVECs迁移和血管生成，增加LC3 II和P62积累，降低cathepsin D表达，增加炎性细胞因子（TNF-α, IL-6, IL-8, MCP-1）分泌；Co-IP和免疫荧光证实STX17与STING相互作用，STING敲低增强自噬流。
- 研究意义
- 该研究揭示了STX17与STING的相互作用在AS中的潜在机制，为AS的防治提供了可能的干预靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建体外AS模型并检测STX17表达
在细胞水平验证STX17表达变化
使用ox-LDL处理HUVECs建立体外AS模型，检测不同浓度和处理时间下STX17表达。通过划痕实验和管形成实验验证细胞损伤。
敲低STX17并评估细胞功能
确定STX17对HUVECs功能的影响
使用shRNA-STX17慢病毒感染HUVECs敲低STX17，通过CCK8检测增殖，划痕实验检测迁移，管形成实验检测血管生成。
评估STX17敲低对自噬和溶酶体功能的影响
探索STX17敲低对自噬流和溶酶体的影响
通过Western blot检测自噬相关蛋白LC3 II、P62、LAMP1和cathepsin D的表达，并使用mRFP-GFP-LC3双荧光腺病毒监测自噬流。
检测STX17敲低对炎症反应的影响
确定STX17敲低对HUVECs炎症反应的影响
通过ELISA检测ox-LDL诱导的HUVECs上清中TNF-α、IL-6、IL-8和MCP-1的水平。
验证STX17与STING的相互作用
确认STX17与STING之间的相互作用
通过Western blot检测STX17敲低后STING表达水平，使用Co-IP和免疫荧光共定位验证相互作用。
敲低STING并评估自噬流
确定STING敲低对自噬流的影响
使用STING-siRNA转染HUVECs敲低STING，通过qPCR和Western blot验证敲低效率，并检测自噬相关蛋白LC3 II和p62的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | 西方饮食（高脂饮食） | -- | -- |
| 细胞培养 | 内皮细胞培养基 | ScienCell | -- |
| 胎牛血清 | ScienCell | -- | |
| 内皮细胞生长补充剂 | ScienCell | -- | |
| 青霉素和链霉素 | ScienCell | -- | |
| 氧化低密度脂蛋白 | Yiyuan Biotechnologies | YB-002 | |
| 慢病毒感染 | shSTX17慢病毒 | HANBIO | pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO |
| 自噬流分析 | mRFP-GFP-LC3腺病毒 | HANBIO | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Scientific | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| qRT-PCR | HiScript III 一步法反转录预混液（qPCR专用） | Vazyme | -- |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | PC0020 |
| 5×蛋白上样缓冲液 | Yamei | LT101 | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 脱脂牛奶 | BioFroxx | 1172GR100 | |
| STX17抗体 | Sigma | HPA001204 | |
| LC3 I/II抗体 | CST | 12741 | |
| SQSTM1/p62抗体 | Abcam | ab109012 | |
| LAMP1抗体 | Abcam | ab108597 | |
| 组织蛋白酶D抗体 | Abcam | ab6313 | |
| STING抗体 | Abcam | ab239074 | |
| β-微管蛋白抗体 | Proteintech | 66240-1-Ig | |
| GAPDH抗体 | ZSGB-BIO | TA-08 | |
| β-肌动蛋白抗体 | ZSGB-BIO | TA-09 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | -- | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | -- | -- | |
| 免疫共沉淀 | Pierce蛋白A/G磁珠 | Thermo Scientific | -- |
| 细胞增殖检测 | CCK8试剂盒 | DojinDo | -- |
| 管形成实验 | Matrigel基质胶 | Corning | -- |
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Elabscience | -- | |
| IL-8 ELISA试剂盒 | Elabscience | -- | |
| MCP-1 ELISA试剂盒 | Elabscience | -- | |
| 免疫荧光染色 | Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG | -- | -- |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG | -- | -- | |
| 细胞培养 | ibidi 2孔腔室载玻片 | ibidi | -- |
| 免疫荧光染色 | 含DAPI的抗淬灭封片剂 | -- | -- |
| 显微镜成像 | 激光共聚焦显微镜LSM 980 | Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建 | 动物品系、周龄、性别；饮食类型和持续时间；分组和样本量；环境条件 阅读提示：见2.1节和3.1节 |
| 细胞模型构建 | HUVECs来源和传代；ox-LDL浓度和处理时间；培养基成分 阅读提示：见2.5节和3.2节 |
| STX17敲低 | 慢病毒载体和序列；感染复数（MOI）；转染时间；筛选抗生素浓度和时间 阅读提示：见2.6节 |
| 自噬流检测 | mRFP-GFP-LC3腺病毒使用浓度；转染时间；ox-LDL处理条件；图像分析参数 阅读提示：见2.7节和3.4节 |
| STING敲低 | siRNA序列和浓度；转染时间；敲低效率验证 阅读提示：见2.8节和3.7节 |
| 炎症因子检测 | ELISA试剂盒品牌和货号；上清收集时间和条件；检测波长 阅读提示：见2.15节和3.5节 |