数据收集与预处理
获取HCC患者转录组、临床和基因组数据，以及二硫化物应激性死亡相关基因列表。
从GDC数据库获取TCGA-LIHC队列，从GEO获取GSE15654和GSE78220队列，收集31个disulfrgs。对表达谱进行FPKM转TPM并取log2。
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通过机器学习识别肝细胞癌中的二硫化物应激性死亡亚型并初步探索其与免疫治疗的联系
Identifying disulfidptosis subtypes in hepatocellular carcinoma through machine learning and preliminary exploration of its connection with immunotherapy.
实验完整度
高研究包含多种独立证据层级：TCGA及外部队列的转录组分析、细胞实验（增殖、F-actin染色、PBMC共培养）及临床样本免疫组化验证，并包含功能验证和机制探索。
主要模型
HCC细胞系MHCC97H、LM3 人正常肝细胞LX2 TCGA-LIHC队列 GSE15654及GSE78220验证队列 18例HCC患者临床样本
重点核对
NMF聚类基于31个disulfrgs，选择k=2 disulfS模型包含NEIL3、MMP1、STC2、ADH4、CFHR3 细胞实验中BAY-876浓度为5 μM，处理时间为8小时 细胞实验使用细胞死亡抑制剂（Ferr-1、Nec-1、Nec-2、CQ、Z-VAD-FMK、DFOM），浓度分别为10 μM、5 μM、5 μM、25 μM、10 μM、100 μM PBMC共培养体系中效应细胞:靶细胞比例为1:10
摘要
背景：肝细胞癌（HCC）是一种高度普遍且致命的癌症，晚期患者的治疗选择有限。二硫化物应激性死亡（Disulfidptosis）是一种最近发现的程序性细胞死亡机制，发生在SLC7A11高表达细胞中，由葡萄糖饥饿诱导的细胞二硫键骨架解体所致。我们旨在探索二硫化物应激性死亡作为HCC预后和治疗标志物的潜力。方法：我们基于31个二硫化物应激性死亡相关基因（disulfrgs）的转录谱，使用非负矩阵分解（NMF）算法将HCC患者分为两个二硫化物应激性死亡亚型（C1和C2）。进一步，通过Cox回归分析和机器学习算法筛选出五个基因（NEIL3、MMP1、STC2、ADH4和CFHR3）构建二硫化物应激性死亡评分系统（disulfS）。使用细胞增殖实验、F-actin染色和PBMC共培养模型验证二硫化物应激性死亡在HCC中发生并与免疫治疗反应相关。结果：我们的结果表明，低二硫化物应激性死亡亚型（C2）表现出更好的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）预后，同时免疫抑制性细胞浸润水平较低，甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢通路激活。此外，低二硫化物应激性死亡组显示出更好的免疫治疗反应，并与索拉非尼治疗存在潜在的拮抗作用。作为总生存风险因素，disulfS在多个验证队列中表现出较高的预测效能。我们证明了HCC细胞中存在二硫化物应激性死亡及其与免疫治疗增敏的可能相关性。结论：本研究表明，与二硫化物应激性死亡相关的新型生物标志物可能作为肝癌有用的临床诊断指标，能够预测预后并识别潜在的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探索二硫化物应激性死亡在肝细胞癌中的预后和治疗标志物价值，并验证其与免疫治疗反应的关系。
- 核心机制
- 低二硫化物应激性死亡亚型（C2）预后较好，与免疫抑制性细胞浸润水平较低及甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢通路激活相关。
- 主要证据
- 基于TCGA-LIHC队列的NMF聚类、disulfS模型的构建和验证（多个队列的OS/PFS预测），以及细胞实验（细胞增殖、F-actin染色、PBMC共培养）和临床样本免疫组化验证。
- 研究意义
- disulfS可作为肝癌的临床诊断指标，预测预后和识别潜在治疗靶点，指导个体化免疫治疗方案的制定。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
二硫化物应激性死亡亚型鉴定
基于31个disulfrgs的表达谱，使用NMF算法将HCC患者分为不同亚型。
使用NMF聚类（brunet方法，10次迭代），选择cophenetic下降最快的秩（k=2），将样本分为C1和C2亚型。通过tSNE可视化，比较亚型间生存、临床特征、免疫浸润和代谢通路差异。
构建亚型区分模型
识别能区分C1和C2亚型的关键基因，并构建预测模型。
对1006个DEGs进行随机森林分析，筛选重要性得分>4的基因（SLC7A11、SLC2A1、ADAM9、ITGAV、PFKP），并构建人工神经网络模型。
构建disulfS预后评分系统
进一步筛选与免疫相关的基因，建立量化二硫化物应激性死亡状态的评分系统，并验证其预后预测能力。
通过WGCNA识别与免疫浸润相关的关键模块（蓝色模块），与DEPGs取交集得到503个Siggs，再进行LASSO回归和多因素Cox回归，最终确定5个基因（NEIL3、MMP1、STC2、ADH4、CFHR3）构建disulfS。
disulfS预后效能验证
在多个队列中验证disulfS对HCC患者OS和PFS的预测能力。
在TCGA训练集、内部验证集、外部验证集（GSE15654）中绘制KM曲线、ROC曲线和校准曲线，评估1年、3年和5年OS预测准确性；并分析不同临床亚组（stage和grade）中的预测能力。
disulfS与免疫治疗及药物敏感性关联分析
评估disulfS预测免疫治疗反应和药物敏感性的能力。
分析disulfS与IPS、TIDE exclusion评分、PD-1治疗队列（GSE78220）的关联，并用pRRophetic预测索拉非尼IC50。
细胞实验验证二硫化物应激性死亡
验证二硫化物应激性死亡在HCC细胞中发生，并探究其与免疫反应的关系。
在MHCC97H和LM3细胞中，使用BAY-876（GLUT1抑制剂）联合各种细胞死亡抑制剂处理8小时，检测细胞活力；F-actin染色观察细胞骨架变化；将处理后的HCC细胞与PBMC共培养，检测细胞因子分泌。
临床样本验证disulfS
验证disulfS在临床样本中与预后的关联，并探索其在HBV阳性/阴性患者中的差异。
对18例HCC患者病理切片进行五个DPRGs（NEIL3、MMP1、STC2、ADH4、CFHR3）的免疫组化染色，计算IOD值，并根据中位数分为高/低disulfS组，进行KM生存分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素G | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| RNA提取 | Fastern试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript逆转录试剂盒 | TaKaRa | -- |
| SYBR Green PCR预混液 | -- | -- | |
| 细胞活力测定 | CCK8试剂 | Biosharp | BS350B |
| 坏死性凋亡抑制剂-1 | MedChemExpress | HY-15760 | |
| 坏死性凋亡抑制剂-2 | MedChemExpress | HY-14622 | |
| 氯喹 | MedChemExpress | HY-17589A | |
| Z-VAD-FMK | MedChemExpress | HY-16658B | |
| 甲磺酸去铁胺 | MedChemExpress | HY-B0988 | |
| 铁死亡抑制剂-1 | MedChemExpress | HY-100579 | |
| BAY-876 | -- | -- | |
| F-actin染色 | 鬼笔环肽-iFluor 555 | abcam | ab176756 |
| DAPI | -- | -- | |
| 荧光显微镜 | 蔡司倒置荧光显微镜（Vert A1） | Zeiss | Vert |
| 酶标仪 | BIOTEK ELX800酶标仪 | BIOTEK | ELX800 |
| 免疫组化 | ADH4抗体 | Abiowell Biotechnology | AWA48164 |
| NEIL3抗体 | Abiowell Biotechnology | AWA52502 | |
| STC2抗体 | Abiowell Biotechnology | AWA48163 | |
| CFHR3抗体 | Proteintech | 16583-1-AP | |
| MMP1抗体 | Proteintech | 10371-2-AP | |
| PBMC共培养 | 外周血单个核细胞（CP-H182） | Prosperity Life Sciences Co. | CP-H182 |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| ELISA | IL-1β ELISA试剂盒 | Servicebio | -- |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Servicebio | -- | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience | -- | |
| 数据分析 | R语言 | -- | -- |
| Perl语言 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 数据收集与预处理 | TCGA-LIHC队列的样本量（371肿瘤，50正常），用于NMF聚类的31个disulfrgs列表，表达谱标准化方法（FPKM转TPM，log2(TPM+1)） 阅读提示：Methods: Data collection and cleaning |
| NMF聚类 | NMF算法参数（brunet方法，10次迭代，k=2） 阅读提示：Methods: The NMF clustering based on 31 disulfrgs |
| disulfS模型构建 | 筛选出的5个基因（NEIL3, MMP1, STC2, ADH4, CFHR3）及其回归系数，LASSO和Cox回归的参数设置（如交叉验证次数） 阅读提示：Methods: Construction and validation of disulfidptosis scoring system |
| 细胞活力测定 | 细胞系（MHCC97H, LM3），BAY-876浓度（5 μM），处理时间（8小时），细胞死亡抑制剂浓度（Ferr-1 10 μM, Nec-1 5 μM, Nec-2 5 μM, CQ 25 μM, Z-VAD-FMK 10 μM, DFOM 100 μM），CCK8试剂使用量（10%） 阅读提示：Methods: Cell viability assay and reagents; Figure 6E-F |
| F-actin染色 | 细胞接种密度（2×10^5），处理时间（8小时），固定和透化条件（4%多聚甲醛，0.5% Triton X-100），染色条件（100 μM Phalloidin-iFluor 555，室温30分钟） 阅读提示：Methods: Fluorescence staining of actin filaments; Figure 6G |
| PBMC共培养 | PBMC来源（CP-H182），共培养比例（效应细胞2×10^5，靶细胞2×10^6/mL），共培养时间（48小时），BAY-876处理浓度（5 μM） 阅读提示：Methods: PBMC were obtained and co-cultured with HCC cell lines; Figure 6H-J |
| 免疫组化 | 样本量（18例）及HBV状态，抗体来源和稀释度（文中未明确说明），染色步骤（脱蜡、抗原修复、封闭等） 阅读提示：Methods: Immunohistochemical staining and integrated optical density (IOD) analysis; Figure 6P |