产乳酸乳杆菌与利用乳酸的微小韦荣球菌的互惠作用:乳酸和谷氨酸交叉喂养促进生长和短链脂肪酸的产生

Mutualistic interactions of lactate-producing lactobacilli and lactate-utilizing Veillonella dispar: Lactate and glutamate cross-feeding for the enhanced growth and short-chain fatty acid production.

作者信息Shi-Min Zhang, Jia-He Hung, Tran Ngoc Yen, Shir-Ly Huang
PMID38801349
发布时间2024-05
DOI10.1111/1751-7915.14484

实验完整度

高

包含体外共培养、生长与代谢物分析、耗竭培养基实验以及双RNA测序转录组分析,涉及功能验证和机制验证,多个独立证据层级。

主要模型

嗜酸乳杆菌ATCC 4356T与微小韦荣球菌ATCC 17748T共培养体系 副干酪乳杆菌副副干酪亚种ATCC 27216T与微小韦荣球菌共培养体系 植物乳杆菌ATCC 10241与微小韦荣球菌共培养体系

重点核对

共培养时使用TYLG培养基,含5.0 g/L胰蛋白胨、3.0 g/L酵母提取物、1.12 g/L L-乳酸钠、1.8 g/L葡萄糖等,pH 7.0 共培养接种量为两菌各1.5 mL过夜培养物,于100 mL TYLG培养基中进行 生长曲线在0, 1.5, 3.5, 5, 7, 9, 11, 13.5, 16, 24小时取样,测定浊度、活菌数、pH和代谢物 活菌计数使用TYG琼脂(嗜酸乳杆菌)和TYL琼脂(微小韦荣球菌),厌氧条件(85% N2, 10% CO2, 5% H2)37°C培养48小时 RNA-seq在共培养对数期(6.5 h)和早期稳定期(13.5 h)取样,使用Illumina NovaSeq 6000平台,差异表达阈值为log2 fold change >1或<-1

摘要

人类肠道为微生物-微生物和宿主-微生物相互作用提供了众多生态位。人类的肠道乳酸稳态至关重要,并依赖于多种细菌。韦荣球菌属,肠道利用乳酸的细菌,和产乳酸菌经常被共同分离。最近的一项临床试验揭示,人体内的产乳酸菌将乳酸交叉喂养给韦荣球菌属;然而,它们的种间相互作用机制仍不清楚。微小韦荣球菌,一种常见于人类肠道和口腔的严格厌氧菌,将乳酸发酵为乙酸和丙酸。在我们的研究中,我们调查了微小韦荣球菌ATCC 17748T与三个具有系统发育距离的乳酸菌代表菌株,嗜酸乳杆菌ATCC 4356T、副干酪乳杆菌副副干酪亚种ATCC 27216T和植物乳杆菌ATCC 10241之间的相互作用。在细菌相互作用期间检查了细菌生长、活力、代谢和基因水平适应。微小韦荣球菌与嗜酸乳杆菌表现出最高程度的互惠共生。在微小韦荣球菌与嗜酸乳杆菌的共培养中,两种细菌都表现出增强的生长和增加的活力。微小韦荣球菌表现出氨基酸生物合成途径和天冬氨酸分解代谢途径的上调。嗜酸乳杆菌也表现出相当数量的与生长和乳酸发酵相关的上调基因。我们的结果支持微小韦荣球菌能够通过推测消耗产生的乳酸来增强嗜酸乳杆菌的发酵能力,并且嗜酸乳杆菌在共培养期间不仅交叉喂养乳酸,还交叉喂养谷氨酸给微小韦荣球菌。交叉喂养的谷氨酸进入微小韦荣球菌的中心碳代谢。这些发现突显了一种复杂的代谢关系,其特征是乳酸和谷氨酸的交叉喂养与嗜酸乳杆菌(产乳酸)和微小韦荣球菌(利用乳酸)内的显著基因调控并行。在短链脂肪酸的产生中,阐明了传统益生菌细菌和潜在下一代益生菌细菌之间互惠相互作用的机制。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
乳酸产生的乳杆菌与乳酸利用的微小韦荣球菌之间的种间相互作用机制是什么?
核心机制
微小韦荣球菌通过消耗乳酸增强嗜酸乳杆菌的发酵能力,而嗜酸乳杆菌不仅交叉喂养乳酸,还交叉喂养谷氨酸给微小韦荣球菌,谷氨酸进入微小韦荣球菌的中心碳代谢。
主要证据
共培养实验显示微小韦荣球菌与嗜酸乳杆菌共培养时生长和SCFA产生显著增加;耗竭培养基实验和氨基酸分析表明谷氨酸交叉喂养;双RNA测序显示微小韦荣球菌上调氨基酸生物合成和天冬氨酸分解代谢通路,嗜酸乳杆菌上调生长和乳酸发酵相关基因。
研究意义
研究阐明传统益生菌和潜在下一代益生菌之间的代谢互惠机制,为开发新型益生菌产品或组合益生菌提供方向。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

菌株共培养与生长代谢监测

评估微小韦荣球菌与三种乳杆菌共培养时的生长和代谢物变化,筛选具有最强互惠作用的组合。

将微小韦荣球菌分别与嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌副副干酪亚种和植物乳杆菌在TYLG培养基中共培养,定时取样测定浊度、活菌数、pH、乳酸、乙酸、丙酸和葡萄糖浓度。

2

耗竭培养基实验

验证一菌产生的环境条件对另一菌生长的方向性影响,并排除仅乳酸交叉喂养的单一机制。

收集嗜酸乳杆菌单培养(L-耗竭)、微小韦荣球菌单培养(V-耗竭)和共培养(C-耗竭)的上清液,制备100%和10%耗竭培养基,分别培养目标菌,测定生长和代谢物。

3

氨基酸含量分析

分析共培养上清液中氨基酸组成变化,揭示是否存在氨基酸交叉喂养。

使用LC-MS/MS分析L-耗竭、V-耗竭和C-耗竭培养基中的氨基酸含量,比较与TYLG培养基的差异。

4

双RNA测序转录组分析

揭示共培养条件下两种细菌的基因表达变化,鉴定参与代谢互作的通路和基因。

提取对数期和早期稳定期的单培养和共培养细菌总RNA,进行RNA-seq,分析差异表达基因和KEGG通路富集。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
胰蛋白胨BD Difco--
酵母提取物BD Difco--
L-乳酸钠Sigma-Aldrich--
葡萄糖Sigma-Aldrich--
吐温80Sigma-Aldrich--
磷酸氢二钾Sigma-Aldrich--
磷酸二氢钾Sigma-Aldrich--
琼脂BD Difco--
葡萄糖比色测定试剂盒Elabscience--
琥珀酸TCI--
浓盐酸Sigma-Aldrich--
尼龙膜Dikma--
高效液相色谱-光电二极管阵列检测系统(岛津LC-2030)Shimadzu--
聚偏二氟乙烯膜Millipore--
ACQUITY超高效液相色谱Waters--
Xevo Q-TOF G2-XS质谱仪Waters--
Presto微型RNA细菌提取试剂盒Geneaid--
Qubit荧光计(Qubit 4)ThermoFisher Scientific--
NanoPhotometer分光光度计----
自动化毛细管电泳系统(Agilent FA5200)Agilent--
Illumina Ribo-Zero Plus rRNA去除试剂盒Illumina--
NovaSeq 6000测序平台Illumina--
厌氧手套箱(Forma Scientific model 1025)ThermoFisher Scientific--
分光光度计(UV-1800)Shimadzu--
光学显微镜(ZEISS Axio Lab A1)ZEISS--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细菌培养与共培养
TYLG培养基成分、pH 7.0、接种量(单培养3 mL过夜培养物,共培养各1.5 mL)、培养条件(85% N2, 10% CO2, 5% H2, 37°C无摇动)、取样时间点
阅读提示:Methods: Bacterial strains, growth media and culture conditions; Monoculture and co-culture of lactobacilli and V. dispar
活菌计数
琼脂平板类型(TYG和TYL)、厌氧培养48小时、稀释倍数和涂布体积100 μL
阅读提示:Methods: Determination of bacterial numbers
代谢物分析
葡萄糖比色试剂盒、SCFA提取方法、HPLC-PDA系统、乳酸、乙酸、丙酸、葡萄糖浓度
阅读提示:Methods: Quantitative analysis of main carbon sources and metabolites in the medium
耗竭培养基实验
耗竭培养基制备(离心、过滤)、使用比例(10%和100%)、初始糖和乳酸浓度
阅读提示:Methods: The preparation of the spent medium ...
双RNA测序
取样时间(对数期和早期稳定期)、RNA提取试剂盒、文库制备试剂盒、测序平台、差异表达阈值
阅读提示:Methods: Dual-RNA sequencing ...