泛素链合成与纯化
获得用于下拉实验的各种泛素链（单泛素、K48/K63同型或分支二聚体/三聚体）
利用重组E1/E2酶在体外酶促合成K48和K63连接的同型和分支泛素链，并通过凝胶过滤纯化，用UbiCRest和质谱验证链组成。
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K48和K63连接的多聚泛素链相互作用组揭示分支特异性和长度特异性的泛素相互作用蛋白
K48- and K63-linked ubiquitin chain interactome reveals branch- and length-specific ubiquitin interactors.
实验完整度
高包含体外泛素链合成、下拉质谱筛选、Western blot验证、SPR结合实验和酵母模型，多个独立证据层级。
主要模型
HeLa细胞裂解液 酿酒酵母裂解液 体外重组泛素链 HIP1 ANTH结构域(22-309)
重点核对
泛素链类型（K48/K63同型和K48/K63分支Ub3） DUB抑制剂（CAA或NEM）处理裂解液 样本来源（HeLa或酿酒酵母） 下拉结合和质谱鉴定 SPR验证HIP1与不同泛素链的结合亲和力
摘要
泛素相互作用蛋白下拉结合质谱法阐明了K48和K63连接的相互作用组，包括新的异型分支和链长度特异性的结合蛋白。该筛选为理解复杂的泛素结构如何被读取奠定了基础。泛素代码表示复杂的泛素结构，包括不同长度、连接类型和连接组合的泛素链，这使得泛素化能够控制广泛的蛋白质命运。虽然已经描述了许多连接特异性相互作用蛋白，但相互作用蛋白如何解码更复杂的结构尚未完全了解。我们在人类和酵母中进行了泛素相互作用蛋白筛选，使用不同长度的泛素链，以及两种最丰富的连接类型——赖氨酸48连接和赖氨酸63连接的泛素——的同型和异型分支链。我们鉴定了一些首批K48/K63连接分支特异性泛素相互作用蛋白，包括组蛋白ADP-核糖转移酶PARP10/ARTD10、E3连接酶UBR4和亨廷顿蛋白相互作用蛋白HIP1。此外，我们通过鉴定对泛素三聚体（Ub3）优于泛素二聚体（Ub2）的相互作用蛋白，包括泛素定向内切蛋白酶DDI2、自噬受体CCDC50和p97适配器FAF1，揭示了链长度的重要性。关键的是，我们比较了使用两种常见去泛素化酶抑制剂——氯乙酰胺和N-乙基马来酰亚胺收集的数据集。这揭示了依赖于抑制剂的相互作用蛋白，强调了抑制剂选择在下拉研究中的重要性。该数据集是理解泛素代码如何被读取的关键资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 泛素相互作用蛋白如何解码K48和K63连接的不同长度和分支的泛素链？
- 核心机制
- K48/K63分支泛素链可能作为复合信号被特异性读取，链长度影响结合偏好，且不同DUB抑制剂影响相互作用蛋白鉴定。
- 主要证据
- 通过泛素下拉质谱筛选，鉴定出K48/K63分支特异性相互作用蛋白如HIP1、PARP10、UBR4，以及链长度偏好性蛋白如DDI2、CCDC50，并用SPR验证HIP1的分支特异性。
- 研究意义
- 该数据集为理解泛素代码的读取机制提供资源，并为研究K48/K63分支泛素在DNA损伤修复和亨廷顿病等过程中的作用提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
泛素相互作用蛋白下拉实验
从细胞裂解液中富集与特定泛素链结合的蛋白质
将生物素化的泛素链固定在链霉亲和素树脂上，与抑制剂处理的人HeLa或酵母裂解液孵育，洗涤后通过质谱鉴定相互作用蛋白。
质谱数据处理与统计比较
鉴定链类型特异性和长度依赖性的泛素相互作用蛋白
使用MaxQuant和R进行蛋白鉴定和定量，通过预过滤（与bead-only对照比较）筛选泛素富集蛋白，然后使用moderated F test和t test比较不同链类型间的富集差异。
Western blot验证
验证质谱发现的特异性相互作用蛋白的富集模式
使用相同的下拉实验，对目标蛋白进行免疫印迹分析。
SPR验证HIP1分支特异性
定量验证HIP1 ANTH结构域对K48/K63分支泛素链的特异性结合
使用表面等离子体共振技术，将生物素化的HIP1(22-309)固定在芯片上，注射不同泛素链，计算解离常数KD。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 泛素链合成 | TALON金属亲和树脂 | Takara | -- |
| 谷胱甘肽Sepharose 4B磁珠 | Cytiva | -- | |
| Affi-Gel 19树脂 | Bio-Rad | -- | |
| Amicon Ultra离心过滤器 | Millipore | -- | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 pg色谱柱 | Cytiva | -- | |
| 泛素链质量分析 | Agilent 6230 b液相色谱-飞行时间质谱仪 | Agilent | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 细胞裂解 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 泛素相互作用蛋白下拉 | 链霉亲和素磁珠 | Cytiva | -- |
| 质谱样品制备 | 测序级胰蛋白酶 | Promega | -- |
| 质谱分析 | Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY-nLC 1200纳升液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| 泛素抗体P4D4 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| HIP1抗体(22231-1AP) | Proteintech | -- | |
| PARP10/ARD10抗体(NB100-2157) | Novus Biologicals | -- | |
| Rad23b抗体(E-AB-62188) | Elabscience | -- | |
| Dsk2抗体(ab4119-100) | Abcam | -- | |
| Epn2抗体 | Invitrogen | -- | |
| DDI2抗体(AB197081) | Abcam | -- | |
| APPL1抗体(D83H4) | Cell Signaling | -- | |
| CCDC50抗体(AB127169) | Abcam | -- | |
| FAF1抗体(1027-1-AP) | Proteintech | -- | |
| ZFAND2B抗体 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Riok3抗体(13593-1-AP) | Proteintech | -- | |
| USP11抗体(22340-1-AP) | Proteintech | -- | |
| 抗小鼠IgG HRP二抗 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 抗兔IgG HRP二抗 | Sigma-Aldrich | -- | |
| SPR | Biacore T200表面等离子体共振仪 | Cytiva | -- |
| Series S传感器芯片NA | Cytiva | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 泛素链合成 | 泛素链类型（K48/K63同型或分支）和长度（Ub2/Ub3） 阅读提示：Materials and Methods: Preparation of Ub chains |
| 下拉实验 | DUB抑制剂类型和浓度（NEM 1 mM或CAA 10 mM），细胞系（HeLa）或酵母菌株（酿酒酵母），泛素链用量（25-50 μg），裂解液用量（2.5-4 mg） 阅读提示：Materials and Methods: Ub interactor pulldown for mass spectrometry |
| 质谱分析 | 质谱仪参数和数据分析软件（MaxQuant 2.0.3.0） 阅读提示：Materials and Methods: Sample preparation and mass spectrometry, Proteomics analysis |
| SPR验证 | HIP1(22-309)蛋白固定量（约900 RU），运行缓冲液成分，分析物浓度范围（60 nM至250 μM） 阅读提示：Materials and Methods: SPR |