库蠓标本采集与提取物制备
获取用于致敏的库蠓全虫提取物
使用紫外灯诱捕采集库蠓,鉴定并分离雌性未吸血个体,匀浆、超声、离心、过滤制备全虫提取物,并测定蛋白浓度。
Establishment of a mouse allergy model for Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae).
包含行为学观察、组织学检查、血清抗体检测、脾细胞增殖和细胞因子表达等多层次验证,并进行了体内和体外实验。
昆明小鼠模型
小鼠品系:昆明小鼠(6-8周龄) 致敏方案:两步致敏法(腹腔注射20 µg库蠓提取物+2 mg铝佐剂,第0、7、14、21天;皮内注射10 µg库蠓提取物,第28、31、35天) 对照组处理:腹腔注射PBS+铝佐剂,皮内注射PBS 行为学评估:皮内注射后记录1小时内搔抓次数 细胞因子检测:脾细胞经1.5 µg/mL库蠓提取物体外刺激72小时后qPCR检测
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取用于致敏的库蠓全虫提取物
使用紫外灯诱捕采集库蠓,鉴定并分离雌性未吸血个体,匀浆、超声、离心、过滤制备全虫提取物,并测定蛋白浓度。
通过两步致敏法建立库蠓过敏小鼠模型
将昆明小鼠分为库蠓致敏组和对照组,分别进行腹腔注射和皮内注射致敏。
评估致敏小鼠对库蠓提取物的速发过敏反应
在皮内注射后记录小鼠1小时内的搔抓次数,包括用嘴、前爪和后爪搔抓。
评估致敏小鼠皮肤迟发型过敏反应的病理变化
皮内激发后,在不同时间点取皮肤组织,进行HE染色和免疫组化染色,观察炎症浸润和CD4/CD8 T细胞。
检测致敏小鼠血清中特异性IgE、IgG1和IgG2a抗体水平
使用间接ELISA检测不同时间点血清中库蠓特异性抗体水平。
评估库蠓提取物体外刺激对脾细胞增殖的影响
分离脾细胞,用不同浓度库蠓提取物刺激培养72小时,MTT法检测细胞增殖。
检测库蠓提取物刺激后脾细胞中细胞因子mRNA表达变化
用1.5 µg/mL库蠓提取物刺激脾细胞72小时,提取RNA,进行qPCR检测细胞因子表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 标本采集 | 紫外灯诱虫器 | Guang Chu Mei Mie Wen QI | GJ-106 |
| 标本鉴定 | 体视显微镜 | Olympus | SZ61 |
| 提取物制备 | 手持式高速分散器 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd. | -- | |
| 组织学检查 | 徕卡RM2235切片机 | Leica | RM2235 |
| BA400数字显微镜 | Motic Group Co. Ltd. | BA400 | |
| 抗体检测 | IgE ELISA检测试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co. Ltd. | -- |
| IgG ELISA检测试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co. Ltd. | -- | |
| 脾细胞增殖检测 | MTT | -- | -- |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| WD-2102B酶标仪 | Beijing Liu Yi Biotechnology Co. Ltd. | WD-2102B | |
| 细胞培养 | RPMI1640培养基 | -- | -- |
| qPCR | Takara RNA提取试剂盒 | Takara | -- |
| FastKing gDNA去除RT SuperMix试剂盒 | Tiangen Biotechnology (Beijing) Co. Ltd. | -- | |
| SYBR Green qPCR预混液 | MedChemExpress | -- | |
| AGS 4800荧光定量PCR仪 | -- | AGS 4800 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 标本采集与提取物制备 | 采集时间、地点、光诱捕设备;提取物制备中离心条件、过滤孔径和蛋白浓度 阅读提示:Methods 2.1, 2.3 |
| 致敏方案 | 小鼠品系、年龄、性别比例;腹腔和皮内注射的剂量、时间点、体积;佐剂浓度;对照组处理 阅读提示:Methods 2.2, 2.4;图2和图3的图注 |
| 行为学评估 | 记录时间窗口和评分标准 阅读提示:Methods 2.5;图2图注 |
| 组织学检查 | 皮内激发时间、取材时间点;抗体浓度和孵育条件 阅读提示:Methods 2.6;图3和图4图注 |
| 血清抗体检测 | 采血时间点;ELISA试剂盒型号和稀释倍数 阅读提示:Methods 2.7;图5图注 |
| 脾细胞增殖和细胞因子表达 | 脾细胞分离方法;刺激浓度、培养时间;MTT浓度;qPCR引物序列和反应条件 阅读提示:Methods 2.8, 2.9;表1和表2 |