库蠓(双翅目:蠓科)小鼠过敏模型的建立

Establishment of a mouse allergy model for Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae).

作者信息Shuncai Bao, Xue Lu, Shuai Xiang, Xiaohui Hou
PMID38659360
发布时间2024-05
DOI10.1002/vms3.1462

实验完整度

包含行为学观察、组织学检查、血清抗体检测、脾细胞增殖和细胞因子表达等多层次验证,并进行了体内和体外实验。

主要模型

昆明小鼠模型

重点核对

小鼠品系:昆明小鼠(6-8周龄) 致敏方案:两步致敏法(腹腔注射20 µg库蠓提取物+2 mg铝佐剂,第0、7、14、21天;皮内注射10 µg库蠓提取物,第28、31、35天) 对照组处理:腹腔注射PBS+铝佐剂,皮内注射PBS 行为学评估:皮内注射后记录1小时内搔抓次数 细胞因子检测:脾细胞经1.5 µg/mL库蠓提取物体外刺激72小时后qPCR检测

摘要

背景:库蠓是一类普遍存在的吸血蠓(蠓科)。雌蠓具有吸血习性。它们不仅叮咬和骚扰人类和动物,而且可能是疾病传播的重要媒介。因此,建立由库蠓叮咬引起的动物过敏模型非常有利于研究其发病机制和探索治疗方法。材料和方法:本研究使用昆明小鼠建立模型,并通过两步注射蠓提取物进行致敏。使用搔抓行为和组织学检查来检查速发和迟发反应。使用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)检测免疫球蛋白E(IgE)和免疫球蛋白G(IgG)。使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)和ELISA测定法测定脾细胞增殖和细胞因子产生。通过定量实时聚合酶链反应(qPCR)分析了细胞因子基因表达对蠓刺激的反应。结果:行为结果显示,蠓致敏动物的搔抓频率显著增加(p < 0.05)。组织学检查显示,与对照组相比,蠓致敏小鼠注射部位有更多的炎性细胞浸润。蠓致敏组血清中IgE和IgG1抗体水平显著升高(p < 0.05)。用蠓提取物体外刺激脾细胞后,与对照组相比,蠓致敏组的脾细胞数量显著增加。蠓致敏组的qPCR数据显示肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达下调,而白细胞介素(IL)-4、IL-5、IL-10和IL-13的表达增加,但对照组没有(p < 0.05)。结论:在本研究中,使用两步法成功构建了库蠓-小鼠致敏动物模型。该模型的给药方式与自然免疫途径非常一致,并且该模型致敏诱导的免疫反应与蠓叮咬产生的免疫反应相似。 摘要:使用库蠓提取物通过两步法致敏六周龄小鼠,并通过行为学、组织病理学和特异性抗体检测评估模型。免疫组织化学染色显示,与对照小鼠相比,库蠓致敏小鼠真皮组织中CD4和CD8 T细胞的浸润显著增加。血清IgE(p < 0.05)和IgG1(p < 0.05)。库蠓提取物体外刺激诱导脾细胞显著增殖(p < 0.001),且由2型辅助T淋巴细胞诱导的白细胞介素(IL)-4、IL-5、IL-10和IL-13的mRNA表达显著高于对照组(p < 0.05)。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
库蠓叮咬能否引起过敏反应,以及如何建立模拟自然免疫途径的动物模型?
核心机制
库蠓提取物致敏诱导Th2型免疫应答,表现为IL-4、IL-5、IL-10和IL-13表达上调,而Th1型TNF-α表达不变,同时IgE和IgG1抗体水平升高。
主要证据
行为学显示致敏小鼠搔抓频率显著增加;组织学显示真皮炎症浸润及CD4和CD8 T细胞增多;血清IgE和IgG1升高;脾细胞增殖增强;qPCR显示Th2细胞因子表达升高。
研究意义
该模型可作为研究蠓叮咬过敏机制和开发治疗策略的有用工具。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

库蠓标本采集与提取物制备

获取用于致敏的库蠓全虫提取物

使用紫外灯诱捕采集库蠓,鉴定并分离雌性未吸血个体,匀浆、超声、离心、过滤制备全虫提取物,并测定蛋白浓度。

2

小鼠致敏模型建立

通过两步致敏法建立库蠓过敏小鼠模型

将昆明小鼠分为库蠓致敏组和对照组,分别进行腹腔注射和皮内注射致敏。

3

评价速发反应(搔抓行为)

评估致敏小鼠对库蠓提取物的速发过敏反应

在皮内注射后记录小鼠1小时内的搔抓次数,包括用嘴、前爪和后爪搔抓。

4

评价迟发反应(组织学检查)

评估致敏小鼠皮肤迟发型过敏反应的病理变化

皮内激发后,在不同时间点取皮肤组织,进行HE染色和免疫组化染色,观察炎症浸润和CD4/CD8 T细胞。

5

血清特异性抗体检测

检测致敏小鼠血清中特异性IgE、IgG1和IgG2a抗体水平

使用间接ELISA检测不同时间点血清中库蠓特异性抗体水平。

6

脾细胞增殖检测

评估库蠓提取物体外刺激对脾细胞增殖的影响

分离脾细胞,用不同浓度库蠓提取物刺激培养72小时,MTT法检测细胞增殖。

7

脾细胞细胞因子表达检测

检测库蠓提取物刺激后脾细胞中细胞因子mRNA表达变化

用1.5 µg/mL库蠓提取物刺激脾细胞72小时,提取RNA,进行qPCR检测细胞因子表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
紫外灯诱虫器Guang Chu Mei Mie Wen QIGJ-106
体视显微镜OlympusSZ61
手持式高速分散器----
BCA蛋白定量试剂盒Beijing Solarbio Science & Technology Co. Ltd.--
徕卡RM2235切片机LeicaRM2235
BA400数字显微镜Motic Group Co. Ltd.BA400
IgE ELISA检测试剂盒Elabscience Biotechnology Co. Ltd.--
IgG ELISA检测试剂盒Elabscience Biotechnology Co. Ltd.--
MTT----
二甲基亚砜----
WD-2102B酶标仪Beijing Liu Yi Biotechnology Co. Ltd.WD-2102B
RPMI1640培养基----
Takara RNA提取试剂盒Takara--
FastKing gDNA去除RT SuperMix试剂盒Tiangen Biotechnology (Beijing) Co. Ltd.--
SYBR Green qPCR预混液MedChemExpress--
AGS 4800荧光定量PCR仪--AGS 4800

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
标本采集与提取物制备
采集时间、地点、光诱捕设备;提取物制备中离心条件、过滤孔径和蛋白浓度
阅读提示:Methods 2.1, 2.3
致敏方案
小鼠品系、年龄、性别比例;腹腔和皮内注射的剂量、时间点、体积;佐剂浓度;对照组处理
阅读提示:Methods 2.2, 2.4;图2和图3的图注
行为学评估
记录时间窗口和评分标准
阅读提示:Methods 2.5;图2图注
组织学检查
皮内激发时间、取材时间点;抗体浓度和孵育条件
阅读提示:Methods 2.6;图3和图4图注
血清抗体检测
采血时间点;ELISA试剂盒型号和稀释倍数
阅读提示:Methods 2.7;图5图注
脾细胞增殖和细胞因子表达
脾细胞分离方法;刺激浓度、培养时间;MTT浓度;qPCR引物序列和反应条件
阅读提示:Methods 2.8, 2.9;表1和表2