建立皮下TC-1肿瘤模型并实施免疫治疗
建立宫颈癌小鼠模型，并验证疫苗联合免疫治疗对肿瘤生长和生存期的影响
C57BL/6J小鼠皮下接种TC-1细胞，第7、14、21天静脉注射PBS、LM∆+LI∆或LM∆E6E7+LI∆E6E7，监测肿瘤生长和生存期
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李斯特菌载体宫颈癌疫苗候选菌株通过JAK-STAT信号通路减少MDSCs
Listeria-vectored cervical cancer vaccine candidate strains reduce MDSCs via the JAK-STAT signaling pathway.
实验完整度
高体外细胞分化实验、体内动物模型（皮下TC-1肿瘤模型）及多种分子检测（ELISA、WB、流式）验证功能与机制。
主要模型
TC-1细胞皮下荷瘤小鼠模型 骨髓细胞体外诱导MDSCs分化
重点核对
C57BL/6J雌性小鼠，6-8周龄，皮下接种1×10^6个TC-1细胞 治疗组：LM∆E6E7和LI∆E6E7静脉注射，第7、14、21天各100μL 对照组：PBS或LM∆和LI∆ 检测时间点：0、7、28天及观察终点 MDSCs分化诱导：脾脏研磨上清（10%）或IL-6和GM-CSF（20ng/mL）
摘要
背景：免疫抑制状态在癌症患者中普遍存在，增加了肿瘤免疫治疗的复杂性。研究发现，李斯特菌载体肿瘤疫苗在免疫治疗过程中具有免疫应答的双向调节潜力。结果：结果表明，由我们实验室构建的两种宫颈癌疫苗候选菌株LM∆E6E7和LI∆E6E7组成的联合免疫治疗，在体内改善了抗肿瘤免疫应答并抑制了荷瘤小鼠的抑制性免疫应答，证实了李斯特菌载体肿瘤疫苗引起的免疫应答双向调节能力。免疫治疗降低了髓源性抑制细胞（MDSCs）诱导因子的表达水平，进而抑制了MDSCs分化调节因子STAT3蛋白的磷酸化水平，从而减少了MDSCs的形成能力。此外，疫苗可能通过抑制肿瘤组织中JAK1-STAT1和JAK2-STAT3通路的磷酸化水平来降低与MDSCs功能相关的功能分子的表达，从而减弱MDSCs的免疫抑制功能。结论：李斯特菌载体宫颈癌疫苗的免疫治疗显著降低了体内MDSCs的水平及功能，这是破坏免疫抑制的关键点。本研究首次阐明了打破免疫抑制的机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 李斯特菌载体肿瘤疫苗如何在体内打破免疫抑制状态，其具体分子机制是什么？
- 核心机制
- LM∆E6E7和LI∆E6E7联合免疫治疗通过降低MDSCs诱导因子表达，抑制STAT3磷酸化，减少MDSCs分化；并抑制肿瘤组织中JAK1-STAT1和JAK2-STAT3通路磷酸化，减弱MDSCs的免疫抑制功能。
- 主要证据
- 体内实验显示E6E7组小鼠肿瘤生长受抑、生存期延长，MDSCs比例降低；体外骨髓细胞分化实验表明E6E7组脾脏上清诱导MDSCs比例显著低于PBS组；WB显示STAT1和STAT3磷酸化水平降低，ELISA显示诱导因子和趋化因子水平下降。
- 研究意义
- 该研究首次阐明李斯特菌载体肿瘤疫苗通过JAK-STAT信号通路调节MDSCs从而打破免疫抑制的机制，为肿瘤疫苗的免疫调节机制提供基础数据，可能为联合治疗提供新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测免疫细胞比例
评估免疫治疗对脾脏和肿瘤浸润淋巴细胞中免疫细胞比例的影响
用流式细胞术检测脾脏和TILs中CD8+ T细胞、NK、巨噬细胞、Treg、MDSCs比例
血清细胞因子谱分析
鉴定差异表达的细胞因子并关联信号通路
用Bio-Plex检测血清细胞因子浓度，并进行GO和KEGG富集分析
检测MDSCs诱导因子及分化
验证疫苗对MDSCs分化扩张的抑制作用及分子机制
用ELISA检测脾脏中诱导因子水平，用WB检测STAT蛋白磷酸化，并利用骨髓细胞诱导分化实验验证功能
评估MDSCs富集和功能相关分子
验证疫苗对MDSCs募集和免疫抑制功能的抑制作用
用ELISA检测趋化因子，用WB检测JAK-STAT信号通路蛋白磷酸化和功能效应分子表达
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | C57BL/6J小鼠 | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | -- |
| 细胞培养 | TC-1细胞系 | Beijing Silver Amethyst Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 细菌培养 | BHI培养基 | LAND BRIDGE | -- |
| 注射 | 磷酸盐缓冲液 | Solarbio | -- |
| 流式细胞术 | RPMI 1640培养基 | Hyclone | -- |
| Cytofix/Cytoperm | BD PharMingen | -- | |
| 固定/透化试剂盒 | eBioscience | -- | |
| NovoCyte流式细胞仪 | Agilent | -- | |
| 肿瘤组织消化 | 胎牛血清 | Gibco | -- |
| 胶原酶I | Biofroxx | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | TIANGEN | -- | |
| 小鼠肿瘤浸润淋巴细胞分离试剂盒 | Solarbio | -- | |
| 血清细胞因子检测 | Bio-Plex Pro小鼠细胞因子组I | Bio-Rad | -- |
| Bio-Plex MAGPIX系统 | Bio-Rad | -- | |
| ELISA | 匀浆器 | MP Biomedicals | -- |
| ELISA试剂盒 | Elabscience | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | AbMole | -- | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | AbMole | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | -- | |
| 上样缓冲液 | NCM Biotech | -- | |
| 骨髓细胞分离 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 70μm细胞过滤器 | -- | -- | |
| 红细胞裂解液 | -- | -- | |
| 骨髓细胞诱导分化 | 小鼠IL-6重组蛋白 | Pepro tech | -- |
| 小鼠GM-CSF重组蛋白 | Pepro tech | -- | |
| 96孔板 | NEST | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立与治疗 | 小鼠品系、年龄、性别；TC-1细胞来源和数量；接种部位和体积；分组及样本量；给药时间、剂量和途径 阅读提示：Methods: Mice and cells; Therapeutic regimen for tumor-bearing mice |
| 免疫细胞检测 | 脾脏和肿瘤组织的处理、抗体组合和克隆号；孵育时间和温度；流式细胞仪设置 阅读提示：Methods: Detection of immune cells in the spleen by flow cytometry; Detection of immune cells in the tumor tissue by flow cytometry; Additional file 1: Table S3 |
| 细胞因子谱分析 | 血清制备方法；检测试剂盒和仪器；数据分析所用参数 阅读提示：Methods: Detection of cytokine profiles in serum |
| ELISA检测 | 组织匀浆条件、离心参数；ELISA试剂盒操作步骤 阅读提示：Methods: ELISA |
| Western blot检测 | 组织蛋白提取、定量和变性条件；抗体信息（稀释比、克隆号） 阅读提示：Methods: Western blot; Additional file 1: Table S4 |
| 骨髓细胞分化 | 骨髓细胞获取方法；脾脏上清制备；诱导培养基组成和浓度；培养时间和检测方法 阅读提示：Methods: Isolation of mouse bone marrow cells; Induction of the differentiation of bone marrow cells by the supernatant of mouse spleen tissue grinding |