临床样本收集与影像学评估
评估不同牙源性囊肿/肿瘤的骨破坏程度差异。
收集37例颌骨良性病变标本，包括OC、OKC和AM，通过影像学分析计算骨破坏体积，并进行H&E染色、TRAP染色和IHC检测CTSK、MMP9表达。
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L-半胱氨酸促进牙源性囊肿/肿瘤的破坏性活动
L-cysteine contributes to destructive activities of odontogenic cysts/tumor.
实验完整度
高包含患者组织样本的代谢组学分析、影像学及TRAP/IHC检测骨破坏，并利用细胞模型（HaCaT）进行铁死亡和NF-κB通路的功能验证。
主要模型
牙源性囊肿组织（OC） 牙源性角化囊肿组织（OKC） 成釉细胞瘤组织（AM） 人永生化表皮细胞HaCaT
重点核对
纳入37例颌骨良性病变标本，包括OC、OKC和AM，病理诊断由两名资深病理医师确认。 高通量靶向代谢组学使用LC-MS/MS，采用MRM模式，代谢物鉴定基于novogene数据库。 WGCNA分析参数：软阈值4，minModuleSize=10，mergeCutHeight=0.25。 细胞实验：HaCaT细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM，si-CTH转染使用Lipofectamine™ 3000。 铁死亡评估：Erastin处理、GSH、MDA和细胞内亚铁离子水平检测。
摘要
背景：牙源性囊肿/肿瘤可导致严重的骨破坏，影响颌面功能和美观。同时，代谢重编程是疾病的重要标志。代谢流的变化影响疾病的各个方面，尤其是骨相关疾病。目前，对牙源性囊肿/肿瘤发病机制的研究主要集中在基因调控水平，但代谢改变对牙源性囊肿/肿瘤的影响仍未充分探索。材料与方法：使用影像学分析评估不同牙源性病变的病变大小。利用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）和免疫组织化学（IHC）检测牙源性囊肿和肿瘤中骨破坏活性的差异。此外，分别进行代谢组学和加权基因共表达网络分析（WGCNA）以获取代谢组学特征和筛选关键代谢物。通过IHC、免疫荧光和丙二醛比色法分析证实铁死亡抑制对骨破坏的影响。结果：成釉细胞瘤（AM）的骨破坏活性最强，牙源性囊肿（OC）最弱。使用高通量靶向代谢组学描绘了OC、牙源性角化囊肿（OKC）和AM的代谢组学谱。WGCNA和差异分析在OKC和AM中鉴定了L-半胱氨酸。通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析进一步筛选出胱硫醚γ-裂解酶（CTH）。进一步验证了L-半胱氨酸的功能。最后，我们证实CTH通过调节上皮细胞对铁死亡的敏感性影响破坏性活动。结论：对病变组织进行的高通量靶向代谢组学证实了OKC和AM中代谢谱的独特改变。CTH及其代谢物L-半胱氨酸是调节破坏性活动的关键因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 牙源性囊肿/肿瘤（如OC、OKC和AM）中是否存在代谢紊乱，以及这些代谢改变如何影响其骨破坏活性？
- 核心机制
- CTH高表达促进L-半胱氨酸代谢，产生硫化氢，激活NF-κB通路并上调NFS-1，从而增强细胞对铁死亡的耐受性，进而促进骨破坏。
- 主要证据
- 代谢组学显示OKC和AM中L-半胱氨酸及CTH表达升高；体外实验表明CTH敲低使HaCaT细胞对Erastin更敏感，外源性L-半胱氨酸可逆转；IHC显示CTH与CTSK、SLC7A11等表达正相关。
- 研究意义
- 研究为牙源性囊肿/肿瘤的诊断和靶向治疗提供新策略，并可能为基于囊液的液体活检提供新可能。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
高通量靶向代谢组学分析
描绘不同牙源性病变的代谢谱并筛选关键代谢物。
对37例组织样本进行LC-MS/MS代谢组学检测，鉴定697种代谢物；进行PCA、oPLS-DA和WGCNA分析，筛选差异代谢物和代表性模块。
WGCNA和KEGG分析鉴定关键代谢物
鉴定与骨破坏活性相关的代谢模块和关键代谢物。
对代谢物进行WGCNA分析，将代谢物分为10个模块；结合差异分析筛选出L-半胱氨酸和UDP；通过KEGG分析追踪到CTH。
细胞实验验证CTH和L-半胱氨酸的功能
验证CTH及其代谢物L-半胱氨酸对细胞活力、铁死亡敏感性和骨破坏相关分子表达的影响。
在HaCaT细胞中敲低CTH，检测细胞活力、GSH、MDA、亚铁离子水平以及CTSK和MMP9表达；并验证外源性L-半胱氨酸的挽救效应。
机制验证：NF-κB通路和NFS-1
探究CTH/L-半胱氨酸调控铁死亡耐受和骨破坏的分子机制。
通过免疫荧光检测NF-κB核转位，通过Western blot检测CTH敲低后NF-κB、CTSK、MMP9和NFS-1的表达变化；在组织样本中检测NF-κB和NFS-1表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估骨破坏活性
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| TRAP检测 | TRAP试剂盒 | Beyotime | -- |
| 蛋白质提取 | Pierce™ IP裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine™ 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Western blot | 哺乳动物蛋白提取试剂 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | ROCHE | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | ROCHE | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 5×SDS上样缓冲液 | Beyotime | -- | |
| QuickBlock™ Western封闭液 | Beyotime | -- | |
| MDA检测 | MDA检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| GSH检测 | GSH酶联免疫吸附测定试剂盒 | Elabscience | E-EL-0026c |
| 亚铁离子检测 | 细胞亚铁离子比色法试剂盒 | Elabscience | E-BC-K881-M |
| 半胱氨酸检测 | 半胱氨酸检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K352-M |
| 代谢组学分析 | SCIEX QTRAP® 6500+质谱仪 | SCIEX | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 样本类型（OC、OKC、AM）及数量（37例）；病理诊断由两位资深病理医生确认；伦理批准号（IRB-ID: 2021B54）。 阅读提示：Methods: Specimen collection |
| 影像学评估 | 骨破坏体积计算公式：4π/3 * a*b*c/2。 阅读提示：Methods: Imaging analysis |
| 高通量靶向代谢组学 | 组织量（100 mg）、提取溶剂（80%甲醇）、离心条件（4°C，15000g，20min）、仪器（SCIEX QTRAP® 6500+）、代谢物鉴定数据库（novogene）及QC样本（5个）。 阅读提示：Methods: High throughput targeted metabolomics by LC-MS |
| WGCNA分析 | 软阈值（4）、minModuleSize（10）、mergeCutHeight（0.25）。 阅读提示：Methods: WGCNA |
| 细胞培养和转染 | HaCaT细胞系来源；培养基（高糖DMEM+10%FBS）；si-CTH靶序列；转染试剂（Lipofectamine™ 3000）。 阅读提示：Methods: Cells and cell culture; Cell transfection |
| 铁死亡相关检测 | Erastin处理浓度和时间（原文未明确）；GSH、MDA、亚铁离子检测试剂盒及操作步骤。 阅读提示：Methods: MDA colorimetric assay; GSH ELISA; Intracellular ferrous iron assay |