安全性评估
评估菌株的体外安全性，包括溶血性、细胞毒性和抗生素敏感性。
在羊血琼脂平板上划线培养，观察溶血；XTT法检测HT-29和HepG2细胞活力；采用EFSA推荐的抗生素进行MIC测定。
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新型凝结芽孢杆菌菌株CGI314的体外安全性和功能特性研究
In vitro safety and functional characterization of the novel Bacillus coagulans strain CGI314.
实验完整度
高该研究包含多种体外实验：生化检测（抗氧化、胆固醇、乳酸等）、细胞实验（HT-29、HepG2等）、代谢组学分析和模拟胃肠道条件测试，涉及安全性和功能性验证。
主要模型
HT-29 肠上皮细胞系 HT-29-MTX 粘液分泌型肠上皮细胞系 HepG2 肝癌细胞系 Bacillus coagulans CGI314 及其孢子
重点核对
孢子热稳定性测试温度：45°C、75°C、90°C，时间0.5、1、3分钟 模拟胃液条件：0.3%胃蛋白酶，pH 3.0，37°C处理2小时；模拟肠液条件：0.1%胰酶和0.3%胆汁盐，pH 7.5，37°C处理2小时 细胞粘附实验：HT-29和HT-29-MTX细胞以5×10^5细胞/孔，培养21-28天，细菌浓度3.0-8.0×10^7 CFU/ml，共培养3.5小时 抗氧化实验：H2O2浓度2 mM处理，DCF-DA染色浓度60 μM，荧光测定 屏障完整性实验：H2O2浓度1 mM，处理48小时，FITC-dextran浓度1 mg/ml
摘要
背景：凝结芽孢杆菌因其理想的益生菌特性，包括排除病原体、抗氧化、抗菌、免疫调节和食品发酵能力，以及其对极端环境（pH、温度、胃酸和胆汁酸耐受性）的耐受性和由于其内生孢子形成能力而具有的稳定性，在健康相关功能性食品研究中引起了广泛关注。方法：在本研究中，评估了新型菌株凝结芽孢杆菌CGI314的安全性和功能性益生菌属性，包括耐热性、耐胃酸和胆汁盐能力、粘附肠细胞的能力、聚集特性、抑制人类病原体生长的能力、酶谱、使用生化和细胞方法的抗氧化能力、胆固醇同化、抗炎活性以及对过氧化氢（H2O2）诱导的肠上皮屏障破坏的缓解作用。结果：凝结芽孢杆菌CGI314孢子表现出对高温（40°C、70°C和90°C）以及胃酸和胆汁酸（pH 3.0和胆汁盐（0.3%））的耐受性，证明其在胃肠道条件下存活并保持活力的能力。该菌株的孢子和营养体形式能够粘附于产生粘液的肠细胞系，表现出中等的自聚集特性，并能与潜在病原菌共聚集。营养细胞减弱了HT-29肠细胞系中脂多糖（LPS）诱导的促炎细胞因子基因表达，并对多种泌尿道、肠道、口腔和皮肤病原体表现出广谱拮抗活性。代谢组学分析表明其能够通过分解复杂分子或从头合成几种氨基酸、维生素和短链脂肪酸。此外，凝结芽孢杆菌CGI314的强抗氧化能力通过基于酶的方法得到证明，并进一步得到了其在HepG2和HT-29细胞系中的细胞保护和抗氧化作用的支持。此外，凝结芽孢杆菌CGI314显著增加了紧密连接蛋白的表达，并部分改善了H2O2诱导的肠上皮屏障完整性的破坏。讨论：综合这些有益的功能特性，为凝结芽孢杆菌CGI314作为食品中潜在益生菌候选菌株提供了有力证据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在评估新型凝结芽孢杆菌CGI314的安全性和功能性益生菌特性，包括耐热、耐胃酸和胆汁盐、粘附、聚集、抗菌、抗氧化、胆固醇同化、抗炎以及对肠屏障的保护作用。
- 核心机制
- B. coagulans CGI314通过上调紧密连接蛋白（如claudin 1、occludin和cingulin）的mRNA表达，可能增强肠道屏障功能，并部分缓解H2O2诱导的屏障破坏。其抗氧化能力可能通过酶促机制（如过氧化氢酶和谷胱甘肽）和降低细胞活性氧水平实现。抗炎活性表现为抑制LPS诱导的IL-8和CXCL10基因表达。
- 主要证据
- 通过体外实验验证：模拟胃肠道条件下的孢子存活率、细胞粘附实验（HT-29和HT-29-MTX）、抗氧化酶活性测定（总抗氧化、过氧化氢酶、GSH）、H2O2诱导细胞死亡和ROS产生实验、胆固醇同化测定、抗菌活性测定（双层琼脂法）、以及TEER和FITC-dextran渗透实验。
- 研究意义
- 该研究表明B. coagulans CGI314具有多种益生菌特性，有望作为功能性食品中的益生菌候选菌株；同时，首次报道了凝结芽孢杆菌成员对H2O2诱导的肠屏障损伤的缓解作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
耐受性测试
评估孢子在极端温度和模拟胃肠道条件下的存活能力。
将孢子悬浮液分别在45°C、75°C、90°C水浴中处理0.5、1、3分钟，然后进行平板计数。模拟胃液（0.3%胃蛋白酶，pH 3.0）处理2小时，然后模拟肠液（0.1%胰酶，0.3%胆汁盐，pH 7.5）处理2小时，每隔1小时取样计数。
粘附与聚集能力
评估菌株对肠上皮细胞的粘附能力及其自聚集和共聚集特性。
将CGI314孢子悬浮液与HT-29和HT-29-MTX细胞共培养3.5小时后，洗涤并计数粘附细菌。通过96孔板测量OD600值，计算自聚集和共聚集百分比。
抗氧化活性测定
评估菌落的酶法抗氧化能力及其在不同细胞模型中的保护效果。
采用总抗氧化能力试剂盒、过氧化氢酶试剂盒和GSH试剂盒测定细胞裂解液中的抗氧化活性。在HT-29和HepG2细胞中，用DCF-DA荧光探针评估H2O2诱导的ROS产生，并用XTT法测定细胞活力。
代谢物分析
评估菌株在发酵过程中产生的氨基酸、维生素和短链脂肪酸。
使用HPLC-FLD和UHPLC-MS分析TSB培养基中的氨基酸和维生素，使用GC-MS分析UHT牛奶中的氨基酸和SCFA。
抗菌谱测定
评估菌株对多种病原菌的抑制能力。
采用双层琼脂法，将CGI314点种在MRS琼脂上，培养20小时后覆盖含有指示菌的TSA或sBHI琼脂，再培养24小时观察抑菌圈。
抗炎活性评估
评估菌株对LPS诱导的促炎基因表达的影响。
将HT-29细胞与CGI314（活菌或热灭活）预培养20小时，然后加入LPS（10 ng/ml）刺激3.5小时，提取RNA，用qRT-PCR检测IL-8、TNF-α和CXCL10的表达。
屏障保护作用
评估菌株对H2O2诱导的肠屏障破坏的保护作用。
使用分化成熟的HT-29-MTX细胞（培养25-28天），将CGI314或细胞上清液单独或与1 mM H2O2处理，测量TEER和FITC-dextran渗透性，并检测紧密连接蛋白的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证抗氧化和氧化应激保护
验证抗菌效果
验证抗炎效果
评估屏障完整性
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 菌株培养 | 胰蛋白胨大豆肉汤 | Becton, Dickinson and Company | -- |
| MRS肉汤 | Merck | -- | |
| 耐受性测试 | 猪胃黏膜胃蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P6887 |
| 猪胰腺胰酶 | Sigma-Aldrich | P1750 | |
| 胆汁盐 | Sigma-Aldrich | 48305 | |
| 抗氧化活性测定 | 总抗氧化能力检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | MAK187 |
| 过氧化氢酶检测试剂盒 | Cohesion Biosciences | CAK1061 | |
| 还原型谷胱甘肽检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K030-S | |
| 细胞活力检测 | XTT试剂 | -- | -- |
| 胆固醇降低测定 | 总胆固醇微量板检测试剂盒 | -- | CAK1116 |
| 乳酸测定 | 乳酸检测试剂盒 | -- | CAK1177 |
| 抗菌活性测定 | MRS琼脂 | -- | -- |
| 胰蛋白胨大豆琼脂 | -- | -- | |
| 脑心浸液琼脂（含补充物） | -- | -- | |
| 抗炎活性测定 | 大肠杆菌O111:B4脂多糖 | Sigma-Aldrich | L4391 |
| RNA提取 | Monarch总RNA小提试剂盒 | NEB | -- |
| RNA定量 | Qubit RNA宽范围定量试剂盒 | Thermofisher scientific | -- |
| RT-qPCR | Luna通用qPCR预混液 | NEB | -- |
| LunaScript逆转录预混试剂盒 | NEB | -- | |
| 蛋白质印迹 | NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶 | -- | -- |
| iBlot 2凝胶转印仪 | Invitrogen/ThermoFisher Scientific | -- | |
| iBlot 2 NC迷你转印叠 | Invitrogen/ThermoFisher Scientific | -- | |
| 兔抗β-actin、occludin、claudin 1、ZO-1抗体 | ABclonal | -- | |
| SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Scientific | -- | |
| iBright成像系统 | Invitrogen/ThermoFisher Scientific | -- | |
| TEER测量 | Millicell ERS-2电阻仪 | Millipore | -- |
| 屏障通透性 | 4 kDa FITC标记葡聚糖 | -- | -- |
| 仪器 | Multiskan FC酶标仪 | ThermoFisher | -- |
| Varioskan LUX多功能酶标仪 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| BeadBug 6匀浆仪 | -- | -- | |
| Thermo Scientific Vanquish液相色谱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Orbitrap Exploris 240质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 代谢物分析 | Zebron ZB-FFAP气相色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm） | -- | -- |
| 气相色谱7890B | Agilent | -- | |
| 四极杆检测器5977B | Agilent | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 菌株培养 | 培养条件：TSB或MRS肉汤，37°C，24小时 阅读提示：Methods 2.1 |
| 耐受性测试 | 温度处理条件：45°C、75°C、90°C，时间0.5、1、3分钟；模拟胃液成分（胃蛋白酶浓度、pH、时间）；模拟肠液成分（胰酶浓度、胆汁盐浓度、pH、时间） 阅读提示：Methods 2.3, 2.4 |
| 粘附与聚集 | 细胞密度、培养时间（21-28天）；细菌浓度、MOI；共培养时间；聚集测定条件（OD600测量时间点） 阅读提示：Methods 2.5, 2.6 |
| 抗氧化活性 | 细菌浓度（1×10^8 CFU/ml）；试剂盒名称；细胞浓度；H2O2浓度；DCF-DA浓度和染色时间 阅读提示：Methods 2.7, 2.9 |
| 细胞毒性 | 细胞浓度；处理时间（20小时）；XTT浓度和孵育时间 阅读提示：Methods 2.8 |
| 胆固醇降低 | 胆固醇浓度（6 mM）；培养时间（72小时）；取样时间点（0、4、8、24、32、48、72小时） 阅读提示：Methods 2.12 |
| 抗菌活性 | 指示菌种类和培养条件；CGI314浓度；琼脂层组成；培养时间 阅读提示：Methods 2.14 |
| 抗炎活性 | 细菌浓度（2×10^8 CFU/ml）；LPS浓度（10 ng/ml）；共培养时间（20小时）刺激时间（3.5小时） 阅读提示：Methods 2.15 |
| 屏障保护 | HT-29-MTX细胞分化时间（25-28天）；细菌浓度（6-8×10^8 CFU/ml）；H2O2浓度（1 mM）；处理时间（48小时）；TEER测量设备；FITC-dextran浓度和测量时间 阅读提示：Methods 2.16, 2.17 |