体外验证OVM增强DC疫苗的抗原释放与T细胞激活
验证OVM感染肿瘤细胞后释放肿瘤抗原，加载该抗原的DC疫苗能否有效激活T细胞。
将DC分别用对照、OVA、OVM或OVM感染B16-F10-OVA细胞产生的裂解物处理，与OT-I CD8+ T细胞共培养，检测T细胞激活标志物CD69和CD44的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
溶瘤病毒M1作为双功能检查点抑制剂增强DC疫苗的抗肿瘤活性
Oncolytic virus M1 functions as a bifunctional checkpoint inhibitor to enhance the antitumor activity of DC vaccine.
实验完整度
高包含体外细胞共培养、多种小鼠肿瘤模型、基因敲除模型、转录组分析及流式细胞术等多层级验证，并明确功能与机制验证。
主要模型
B16-F10黑色素瘤小鼠模型 CT-26结肠癌小鼠模型 RM-1前列腺癌小鼠模型 Pan02胰腺癌小鼠模型
重点核对
小鼠品系：C57BL/6J或BALB/c，6-8周龄雌性 肿瘤细胞接种量：B16-F10-OVA 1×10^6，B16-F10 0.5~3×10^6，CT-26 3×10^6，RM-1 1×10^6，Pan02 3×10^6 OVM给药：3×10^6 TCID50/剂量，尾静脉注射，连续5天 DC疫苗给药：1×10^6细胞/只，瘤内注射 抗PD-L1抗体：10 mg/kg/剂量，腹腔注射，每两天一次
摘要
Dan等人研究表明，溶瘤病毒M1能够通过破坏肿瘤细胞与树突状细胞之间的SIRPα-CD47免疫检查点来增强DC疫苗的抗肿瘤效果。这种联合疗法与PD-L1阻断联合使用效果更佳，为癌症治疗提供了新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 溶瘤病毒M1能否增强DC疫苗的抗肿瘤效果，其机制为何？
- 核心机制
- OVM通过下调DC上的SIRPα和肿瘤细胞上的CD47，阻断SIRPα-CD47免疫检查点，从而解除肿瘤细胞对DC的抑制，恢复DC功能，增强DC疫苗诱导的CD8+ T细胞抗肿瘤免疫应答。
- 主要证据
- 在多种同基因小鼠肿瘤模型（B16-F10、CT-26、RM-1、Pan02）中，OVM联合DC疫苗显著抑制肿瘤生长并延长生存期；体外实验证实OVM可下调共培养DC的SIRPα和肿瘤细胞的CD47，且SIRPα-KO DC疫苗或CD47-KO肿瘤模型均能增强DC疫苗效果。
- 研究意义
- 该研究为OVM作为DC疫苗的强效佐剂提供理论基础，并提示OVM联合DC疫苗及抗PD-L1抗体的三联疗法有望成为恶性肿瘤的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠肿瘤模型中评估联合治疗效果
评估OVM联合DC疫苗在不同肿瘤模型中的抗肿瘤效果。
在多种同基因小鼠肿瘤模型（B16-F10、B16-F10-OVA、CT-26、RM-1、Pan02）中，植入肿瘤细胞后随机分组，给予OVM（尾静脉，连续5天）、DC疫苗（瘤内注射）、或联合治疗，监测肿瘤体积和生存期。
分析肿瘤微环境中T细胞浸润和功能
验证联合治疗对肿瘤微环境中T细胞浸润、活化和记忆表型的影响。
治疗结束后收集肿瘤组织，制备单细胞悬液，通过流式细胞术分析T细胞比例、CD44表达、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、耗竭T细胞和Treg的比例；分离TIL与肿瘤细胞共培养，检测细胞毒性及IFN-γ分泌。
验证CD8+ T细胞的依赖性
明确联合治疗中CD8+ T细胞的必要作用。
使用抗CD4或抗CD8抗体清除相应T细胞亚群，观察对联合治疗抗肿瘤效果的影响；使用Batf3-KO小鼠（缺乏cDC1）评估联合治疗效果。
研究肿瘤细胞抑制DC的机制
探究肿瘤细胞抑制DC成熟的机制，是否通过细胞接触依赖性方式。
将DC与肿瘤细胞直接共培养、使用肿瘤条件培养基或Transwell系统，检测DC成熟标志物（CD86、CD83、MHC II）表达；通过转录组分析和Western blot检测ITAM/ITIM通路。
鉴定SIRPα-CD47轴的作用
验证肿瘤细胞通过SIRPα-CD47轴抑制DC。
使用SIRPα-KO小鼠来源的DC和CD47-KO B16-F10细胞系，检测DC成熟标志物和细胞因子分泌；在体内使用SIRPα-KO DC疫苗或CD47-KO肿瘤模型评估DC疫苗效果。
验证OVM下调SIRPα和CD47表达
验证OVM是否通过下调SIRPα和CD47来解除肿瘤对DC的抑制。
检测OVM处理后肿瘤细胞CD47和DC上SIRPα的mRNA和蛋白表达；在体内B16-F10模型中检测TME中DC的SIRPα和肿瘤细胞的CD47表达。
澄清MYC转录因子的参与
探究OVM下调SIRPα和CD47是否通过MYC转录因子。
通过GSEA分析、qPCR验证MYC表达变化，并利用ENCODE数据库和TCGA/GTEx数据分析MYC与SIRPα、CD47表达的相关性。
评估PD-L1阻断的联合效果
评估在OVM和DC疫苗联合基础上增加PD-L1阻断的效果。
在B16-F10和CT-26肿瘤模型中，给予OVM、DC疫苗和抗PD-L1抗体三联治疗，监测肿瘤生长和生存期；分析T细胞表型变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875093 |
| DMEM培养基 | Gibco | 11965092 | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099-141 | |
| 青霉素/链霉素 | HyClone | SV30010 | |
| DC分化 | 重组小鼠GM-CSF | PeproTech | 315-03-250 |
| 重组小鼠IL-4 | PeproTech | 214-14-100 | |
| DC疫苗制备 | 卵清蛋白 | Sigma | A7641 |
| 脂多糖 | InvivoGen | tlrl-rslps | |
| 病毒制备 | VP-SFM培养基 | Gibco | 11681020 |
| 非必需氨基酸溶液 | Gibco | 11140050 | |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | 35050079 | |
| 细胞分离 | EasySep小鼠CD11c阳性分选试剂盒 | STEMCELL Technologies | 18780 |
| T细胞分离 | EasySep小鼠T细胞阴性分选试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19851 |
| EasySep小鼠初始CD8+ T细胞阴性分选试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19858 | |
| TIL分离 | 小鼠肿瘤淋巴细胞浸润试剂盒 | Solarbio | P9000 |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解液 | TIANGEN | RT122 |
| 流式细胞术 | 可固定活力染料510 | BD | 564406 |
| 可固定活力染料780 | BD | 565388 | |
| 转录因子染色 | 转录因子染色缓冲液套装 | BD | 562574 |
| ELISA | 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | 4A Biotech | CME0004 |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | 4A Biotech | CME0006 | |
| 小鼠IFN-β ELISA试剂盒 | 4A Biotech | CME0116 | |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Jingmei Biotech | 02415M1 | |
| 小鼠IL-12 ELISA试剂盒 | Jingmei Biotech | 11506M1 | |
| 小鼠颗粒酶B ELISA试剂盒 | Multi Sciences | EK2173-96 | |
| 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | Multi Sciences | EK280/3-96 | |
| 小鼠穿孔素ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0890c | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Life Technologies | 15596018 |
| RevertAid逆转录酶 | Thermo Fisher | EP0441 | |
| Super Real Pre Mix SYBR Green | Tiangen | FP204-02 | |
| Western blot | M-PER哺乳动物蛋白提取试剂 | Thermo Scientific | 78501 |
| Immobilon Western化学发光HRP底物 | Millipore | WBKLS0500 | |
| CCK8检测 | CCK-8试剂 | -- | -- |
| 流式细胞术 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| RT-qPCR | Applied Biosystems 7500 Fast实时荧光定量PCR系统 | Life Technologies | -- |
| Western blot | ChemiDoc XRS+成像系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肿瘤模型建立 | 小鼠品系、性别、年龄、肿瘤细胞接种量、接种部位 阅读提示：STAR★Methods - Tumor-bearing mouse models 及图例 |
| OVM制备与给药 | OVM剂量、给药途径、给药次数、Vero细胞培养条件 阅读提示：STAR★Methods - OVM preparations 和 In vivo dosing regimen |
| DC疫苗制备 | BMDC培养条件（GM-CSF、IL-4浓度）、抗原加载方式（OVA或oncolysate）、LPS浓度、DC成熟时间 阅读提示：STAR★Methods - Generation of BMDCs and DC vaccine |
| 联合治疗与PD-L1阻断 | OVM、DC疫苗、抗PD-L1抗体的剂量、给药时间、注射途径 阅读提示：STAR★Methods - In vivo dosing regimen |
| 流式细胞术分析 | 组织处理、细胞染色、抗体克隆和稀释倍数、设门策略 阅读提示：STAR★Methods - Flow cytometry |
| 细胞功能检测 | 共培养比例、时间、检测的细胞因子及ELISA试剂盒 阅读提示：STAR★Methods - ELISA、Flow cytometry |