设计sgRNA并构建双sgRNA慢病毒载体
靶向PDCD1基因外显子3两侧，实现外显子跳跃或删除
使用CHOPCHOP和CRISPOR设计sgRNA，克隆至lentiCRISPRv2 puro载体，产生慢病毒颗粒。
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通过CRISPR/Cas9外显子跳跃策略将Jurkat细胞中膜PD-1转化为可溶性形式以逆转T细胞耗竭
Reversing T Cell Exhaustion by Converting Membrane PD-1 to Its Soluble form in Jurkat Cells; Applying The CRISPR/Cas9 Exon Skipping Strategy.
实验完整度
中包含细胞实验（Jurkat编辑、共培养）及分子验证（PCR、RT-PCR、流式、斑点印迹），但缺少动物模型及临床样本验证。
主要模型
Jurkat T细胞系 HEK-293T细胞系 肾癌细胞（RCC）原代细胞 MDA-MB-231乳腺癌细胞系
重点核对
sgRNA靶向PDCD1外显子3上游和下游序列，编辑效率需验证 MOI=10的慢病毒转导Jurkat细胞 PMA (50 ng/mL) 和PHA (1 µg/mL) 激活Jurkat细胞 淋巴细胞与癌细胞共培养的效靶比为10:1 共培养时间为72小时
摘要
目的：T细胞表达程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）的两种功能形式：膜型（mPD-1）和可溶型（sPD-1）。mPD-1与其配体（PD-L1）在肿瘤细胞上的结合可导致活化淋巴细胞走向耗竭。通过PD-1 mRNA外显子3的可变剪接选择性删除跨膜结构域可产生sPD-1。过表达sPD-1可干扰肿瘤特异性T细胞中mPD-1/PD-L1的相互作用。我们研究了来自混合工程和非工程T细胞上清的分泌性sPD-1对肿瘤微环境（TME）中淋巴细胞存活和增殖的影响。材料与方法：在本实验研究中，我们设计了两个靶向PDCD1基因外显子3上游和下游的sgRNA序列。使用lentiCRISPRv2 puro载体克隆双sgRNA并产生慢病毒颗粒以转导Jurkat T细胞。使用分析测定法阐明混合（工程和非工程）Jurkat细胞中PD-1表达模式的变化。建立PD-L1+癌细胞与淋巴细胞的共培养条件。结果：基于TIDE和ICE测序分析报告，CRISPR/Cas9能够在工程细胞中删除PDCD1基因的外显子3。我们的结果显示，CRISPR操作后mPD-1阳性细胞群减少12%，上清中sPD-1浓度增加。增加的sPD-1证实了其对与PDL1+癌细胞共培养的淋巴细胞增殖的积极作用。与混合细胞上清共培养的淋巴细胞存活率比对照组高12.5%。结论：CRISPR/Cas9外显子跳跃方法可用于过继细胞免疫治疗中改变PD-1表达模式并克服耗竭。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 通过CRISPR/Cas9外显子跳跃删除PDCD1外显子3，能否将T细胞mPD-1转化为sPD-1，从而克服T细胞耗竭并改善淋巴细胞功能？
- 核心机制
- 删除PDCD1外显子3导致跨膜结构域缺失，产生可溶性PD-1（sPD-1），sPD-1与肿瘤细胞上的PD-L1结合，阻断mPD-1/PD-L1抑制信号，从而恢复T细胞增殖并减少凋亡。
- 主要证据
- DNA测序显示编辑效率（ICE分析100%），mPD-1表达降低12.85%，sPD-1分泌增加9.7%，共培养实验显示淋巴细胞增殖增加（约55% vs 37%）且凋亡减少（3.3% vs 13.36%）。
- 研究意义
- 该策略可用于过继细胞免疫治疗（如TIL和CAR-T）以克服耗竭，避免系统性免疫检查点阻断的副作用，并可推广至其他抑制性受体。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
慢病毒生产与Jurkat细胞转导
将双sgRNA递送至Jurkat细胞并激活，实现基因编辑
HEK-293T包装慢病毒，qPCR滴定，转导Jurkat细胞，PMA/PHA激活。
验证基因编辑和PD-1表达模式变化
确认外显子3删除及mPD-1向sPD-1转变
提取DNA和RNA，进行PCR、RT-PCR、测序分析、流式细胞术和斑点印迹。
淋巴细胞与肿瘤细胞共培养及功能评估
评估分泌的sPD-1对淋巴细胞增殖和凋亡的影响
分离PBMC并标记CFSE，与PD-L1+癌细胞（RCC和MDA-MB-231）共培养，加入混合细胞上清，通过流式检测增殖和凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 慢病毒包装 | lentiCRISPRv2 puro载体 | Addgene | #98290 |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | #12260 | |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | #12259 | |
| 细胞转染 | 聚乙烯亚胺 | Sigma-Aldrich | -- |
| 病毒浓缩 | 聚乙二醇6000 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞转导 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | -- | |
| 细胞激活 | 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | -- | -- |
| 植物血凝素 | -- | -- | |
| DNA提取 | DNA提取试剂盒 | Gene Transfer Pioneers Co. | -- |
| RNA提取 | SanPrep柱式微量RNA小提试剂盒 | Bio Basic, Inc. | -- |
| BehPrep病毒RNA提取试剂盒 | BehGene Biotech Co. | -- | |
| cDNA合成 | RT-ROSET试剂盒 | ROJE Technologies Co. | -- |
| PCR | Taq DNA聚合酶2x预混液 | Ampliqon | -- |
| RT-PCR | RealQ Plus预混液（绿色高ROX） | Ampliqon | -- |
| 细胞分离 | Ficol-Lymphodex分离液 | Innotrain | -- |
| 细胞标记 | 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 | Sigma-Aldrich | -- |
| 流式细胞术 | FITC抗人CD279（PD-1）抗体 | Sina Biotech Co. | -- |
| APC抗人CD3抗体（OKT-3） | Elabscience | -- | |
| 凋亡检测 | 膜联蛋白V-FITC/7-AAD试剂盒 | Elabscience | -- |
| 斑点印迹 | 生物素化抗人PD-1抗体 | Sina Biotech Co. | -- |
| 链霉亲和素-辣根过氧化物酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| DAB底物 | Roche | -- | |
| 统计分析 | Prism 9 | GraphPad Software, LLC | -- |
| 图像分析 | ImageJ | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| sgRNA设计和载体构建 | sgRNA序列及靶向位置（PDCD1外显子3上游和下游），lentiCRISPRv2 puro、psPAX2和pMD2.G的Addgene编号 阅读提示：Methods中的“Prediction of splicing sites, sgRNA design, and dual cloning” |
| 慢病毒生产和转导 | PEI转染比例（1:2），病毒浓缩方法（PEG 6000），MOI=10，polybrene浓度（8 μg/mL），激活剂浓度（PMA 50 ng/mL，PHA 1 µg/mL） 阅读提示：Methods中的“Lentiviral packaging, titration, transduction, and activation” |
| 编辑效率验证 | Sanger测序分析（TIDE和ICE）的编辑效率，PCR引物序列，RT-PCR引物序列 阅读提示：Methods中的“Analysis of extracted DNA”和“Analysis of synthesised cDNA” |
| 共培养实验 | PBMC分离方法，CFSE标记浓度（5 µM），共培养效靶比（10:1），上清体积（150 µl），共培养时间（72小时） 阅读提示：Methods中的“Co-culture conditions”及Table 1 |