白英清脉方通过抑制HMGB1/RAGE/NF-κB信号通路改善血栓闭塞性脉管炎

Baiying qingmai formulation ameliorates thromboangiitis obliterans by inhibiting HMGB1/RAGE/NF-κB signaling pathways.

作者信息Chongchong Zou, Li Liu, Chuanqi Huang, Song Hu
PMID36304158
发布时间2022-10-11
DOI10.3389/fphar.2022.1018438

实验完整度

研究包含药物成分分析、分子对接、大鼠TAO模型、组织学、ELISA、Western blot和qPCR等多个独立证据层级,且明确包含功能验证(体内症状改善)和机制验证(信号通路蛋白变化)。

主要模型

大鼠TAO模型(右后肢股动脉注射月桂酸钠) 雄性Wistar大鼠,180-220g

重点核对

TAO模型建立:右后肢股动脉注射0.15 ml 1%月桂酸钠(pH 8.0) 分组:Sham、TAO、BF-L(3.85 g/kg)、BF-M(7.71 g/kg)、BF-H(15.42 g/kg)、Cilostazol(68.6 mg/kg) 给药方式:术后12小时开始灌胃,每日一次,持续14天 检测时间点:第7天和第15天观察肢体症状,末次给药后取材

摘要

白英清脉方(BF)是一种经典临床处方,用于治疗血栓闭塞性脉管炎(TAO)已有数十年。尽管它能有效缓解TAO患者的疼痛和缺血性溃疡,但其抗TAO机制仍不清楚。采用高效液相色谱法分析BF的化学成分,并通过分子对接分析BF中化合物的潜在靶点。此外,利用TAO大鼠模型研究了BF治疗TAO的信号通路和分子机制。在BF中鉴定出七种化合物(没食子酸、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、槲皮素和丹皮酚),分子对接预测它们与HMGB1/RAGE/NF-κB蛋白具有高亲和力。在体内研究中,BF不仅抑制股动脉中HMGB1、RAGE、ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达,HMGB1和RAGE的mRNA水平,以及NF-κB、ERK、JNK和p38 MAPK的磷酸化,还降低了血浆中炎症细胞因子(IL-6、TNF-α、IL-1β、HMGB1)和促血栓形成细胞因子TXA2的稳定代谢物(TXB2)的水平。此外,BF刺激了血浆中抑制血栓形成的细胞因子PGI2的稳定代谢物(6-酮-PGF1α)的分泌。BF抑制了股动脉的炎症反应和血栓形成,从而减少了血管闭塞的程度,减轻了TAO大鼠的症状。我们的研究结果表明,BF通过抑制ERK、JNK、p38 MAPK和HMGB1/RAGE/NF-κB信号通路的激活来改善TAO,从而为TAO的治疗提供了新的思路,并为BF作为治疗TAO的有前景药物的进一步开发和利用提供了重要信息。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
白英清脉方(BF)是否通过抑制HMGB1/RAGE/NF-κB信号通路及炎症反应来改善血栓闭塞性脉管炎(TAO)?
核心机制
BF通过抑制HMGB1/RAGE/NF-κB信号通路以及ERK、JNK和p38 MAPK的磷酸化,减少炎症因子释放和血栓形成,从而改善血管炎症和闭塞。
主要证据
大鼠TAO模型中,BF中高剂量降低股动脉HMGB1和RAGE蛋白及mRNA表达,抑制NF-κB和MAPK磷酸化,降低血浆炎症因子和TXB2,升高6-酮-PGF1α,并减轻肢体缺血和血管闭塞。
研究意义
为TAO的治疗提供了新思路,并为BF作为治疗TAO的有前景药物的进一步开发和利用提供了基础信息。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

BF化学成分鉴定

确定BF中的主要化学成分,为后续靶点分析提供基础。

采用HPLC分析BF的化学组成,通过与标准品比对鉴定出没食子酸、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、槲皮素和丹皮酚。

2

分子对接预测化合物与靶蛋白的亲和力

预测BF中化合物与HMGB1/RAGE/NF-κB蛋白的结合亲和力,初步评估其潜在抑制活性。

使用AutoDock Vina将BF中的七种成分与HMGB1(PDB: 6C1K)、RAGE(PDB: 5D3F)、NF-κB(PDB: 2LWW)进行分子对接,并用PyMOL可视化结合模式。

3

建立TAO大鼠模型并分组给药

建立TAO大鼠模型,并评估不同剂量BF的治疗效果。

60只雄性Wistar大鼠随机分为Sham、TAO、BF-L、BF-M、BF-H和Cilostazol组。采用股动脉注射月桂酸钠建立TAO模型,术后12小时开始灌胃给药,持续14天。

4

观察肢体症状与组织病理学

评估BF对TAO大鼠肢体缺血和血管炎症的影响。

记录右后肢的病理表现,并通过H&E染色观察股动脉的组织学变化。

5

血浆炎症因子和血栓相关指标检测

检测BF对血浆中炎症因子和血栓相关物质水平的影响。

使用ELISA试剂盒检测血浆中IL-6、TNF-α、IL-1β、HMGB1、TXB2和6-酮-PGF1α的水平。

6

Western blot检测蛋白表达和磷酸化

检测BF对股动脉中HMGB1/RAGE/NF-κB和MAPK通路蛋白表达及磷酸化的影响。

提取股动脉蛋白,通过Western blotting检测HMGB1、RAGE、ICAM-1、VCAM-1、NF-κB p65及其磷酸化,以及ERK、JNK、p38 MAPK及其磷酸化水平。

7

qPCR检测mRNA表达

检测BF对股动脉中HMGB1和RAGE mRNA水平的影响。

提取股动脉总RNA,逆转录,用qPCR分析HMGB1和RAGE的mRNA表达,以GAPDH为内参。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
LC-20AD高效液相色谱仪Shimadzu Corp--
InertSustain C18色谱柱GL Science Inc.--
AutoDock VinaNational Biomedical Computation Resource--
月桂酸钠Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.--
青霉素钠Huabei Pharmaceutical Co., Ltd--
BX53显微镜OLYMPUS--
大鼠IL-1β ELISA试剂盒Multisciences BiotechEK301BHS
大鼠TNF-α ELISA试剂盒Multisciences BiotechEK382HS
大鼠IL-6 ELISA试剂盒Multisciences BiotechEK306/3
大鼠HMGB1 ELISA试剂盒Elabscience BiotechnologyE-EL-R0505c
TXB2 ELISA试剂盒Elabscience BiotechnologyE-EL-R0965c
6-酮-PGF1α ELISA试剂盒Elabscience BiotechnologyE-EL-0054c
HMGB1抗体Cell Signaling Technology6893S
RAGE抗体Cell Signaling Technology6996S
p-NF-κB p65抗体Cell Signaling Technology3033S
NF-κB p65抗体Cell Signaling Technology8242S
JNK抗体Cell Signaling Technology9252s
p-JNK抗体Cell Signaling Technology4668s
ERK抗体Cell Signaling Technology9102S
p-ERK抗体Cell Signaling Technology4376s
p38 MAPK抗体Cell Signaling Technology8690S
p-p38 MAPK抗体Cell Signaling Technology4511S
GAPDH抗体Cell Signaling Technology5174S
VCAM-1抗体Abcamab134047
ICAM-1抗体Abcamab171123
RIPA裂解液试剂盒Merck KgAA--
PVDF膜MILLIPORE--
增强化学发光试剂MILLIPORE--
凝胶成像系统Bio-Rad--
Trizol试剂Invitrogen--
逆转录试剂盒TaKaRa--
特异性引物TaKaRa--
西洛他唑Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
TAO模型建立
大鼠品系、体重、麻醉剂量、月桂酸钠浓度和体积、注射部位及血流阻断时间
阅读提示:Materials and methods - Grouping of rats and establishment of the TAO model
分组与给药
分组数量、每组样本量、BF剂量(3.85、7.71、15.42 g/kg)、Cilostazol剂量(68.6 mg/kg)、给药途径和持续时间
阅读提示:Materials and methods - Grouping of rats and establishment of the TAO model
血浆细胞因子检测
ELISA试剂盒品牌和货号、血浆处理方法、检测指标
阅读提示:Materials and methods - Analysis of cytokines in the plasma using ELISA
Western blot
抗体品牌和货号、稀释比例、蛋白提取方法、内参设置
阅读提示:Materials and methods - Western blotting
RT-qPCR
引物序列、PCR参数、内参基因、RNA提取方法
阅读提示:Materials and methods - Analysis of mRNA expression using quantitative RT-PCR