BF化学成分鉴定
确定BF中的主要化学成分,为后续靶点分析提供基础。
采用HPLC分析BF的化学组成,通过与标准品比对鉴定出没食子酸、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、槲皮素和丹皮酚。
Baiying qingmai formulation ameliorates thromboangiitis obliterans by inhibiting HMGB1/RAGE/NF-κB signaling pathways.
研究包含药物成分分析、分子对接、大鼠TAO模型、组织学、ELISA、Western blot和qPCR等多个独立证据层级,且明确包含功能验证(体内症状改善)和机制验证(信号通路蛋白变化)。
大鼠TAO模型(右后肢股动脉注射月桂酸钠) 雄性Wistar大鼠,180-220g
TAO模型建立:右后肢股动脉注射0.15 ml 1%月桂酸钠(pH 8.0) 分组:Sham、TAO、BF-L(3.85 g/kg)、BF-M(7.71 g/kg)、BF-H(15.42 g/kg)、Cilostazol(68.6 mg/kg) 给药方式:术后12小时开始灌胃,每日一次,持续14天 检测时间点:第7天和第15天观察肢体症状,末次给药后取材
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定BF中的主要化学成分,为后续靶点分析提供基础。
采用HPLC分析BF的化学组成,通过与标准品比对鉴定出没食子酸、儿茶素、绿原酸、咖啡酸、芍药苷、槲皮素和丹皮酚。
预测BF中化合物与HMGB1/RAGE/NF-κB蛋白的结合亲和力,初步评估其潜在抑制活性。
使用AutoDock Vina将BF中的七种成分与HMGB1(PDB: 6C1K)、RAGE(PDB: 5D3F)、NF-κB(PDB: 2LWW)进行分子对接,并用PyMOL可视化结合模式。
建立TAO大鼠模型,并评估不同剂量BF的治疗效果。
60只雄性Wistar大鼠随机分为Sham、TAO、BF-L、BF-M、BF-H和Cilostazol组。采用股动脉注射月桂酸钠建立TAO模型,术后12小时开始灌胃给药,持续14天。
评估BF对TAO大鼠肢体缺血和血管炎症的影响。
记录右后肢的病理表现,并通过H&E染色观察股动脉的组织学变化。
检测BF对血浆中炎症因子和血栓相关物质水平的影响。
使用ELISA试剂盒检测血浆中IL-6、TNF-α、IL-1β、HMGB1、TXB2和6-酮-PGF1α的水平。
检测BF对股动脉中HMGB1/RAGE/NF-κB和MAPK通路蛋白表达及磷酸化的影响。
提取股动脉蛋白,通过Western blotting检测HMGB1、RAGE、ICAM-1、VCAM-1、NF-κB p65及其磷酸化,以及ERK、JNK、p38 MAPK及其磷酸化水平。
检测BF对股动脉中HMGB1和RAGE mRNA水平的影响。
提取股动脉总RNA,逆转录,用qPCR分析HMGB1和RAGE的mRNA表达,以GAPDH为内参。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 化学成分分析 | LC-20AD高效液相色谱仪 | Shimadzu Corp | -- |
| InertSustain C18色谱柱 | GL Science Inc. | -- | |
| 分子对接 | AutoDock Vina | National Biomedical Computation Resource | -- |
| 动物实验 | 月桂酸钠 | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | -- |
| 青霉素钠 | Huabei Pharmaceutical Co., Ltd | -- | |
| 组织学检查 | BX53显微镜 | OLYMPUS | -- |
| ELISA | 大鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Multisciences Biotech | EK301BHS |
| 大鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Multisciences Biotech | EK382HS | |
| 大鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Multisciences Biotech | EK306/3 | |
| 大鼠HMGB1 ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology | E-EL-R0505c | |
| TXB2 ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology | E-EL-R0965c | |
| 6-酮-PGF1α ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology | E-EL-0054c | |
| Western blot | HMGB1抗体 | Cell Signaling Technology | 6893S |
| RAGE抗体 | Cell Signaling Technology | 6996S | |
| p-NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033S | |
| NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242S | |
| JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252s | |
| p-JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 4668s | |
| ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 9102S | |
| p-ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4376s | |
| p38 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 8690S | |
| p-p38 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 4511S | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174S | |
| VCAM-1抗体 | Abcam | ab134047 | |
| ICAM-1抗体 | Abcam | ab171123 | |
| RIPA裂解液试剂盒 | Merck KgAA | -- | |
| PVDF膜 | MILLIPORE | -- | |
| 增强化学发光试剂 | MILLIPORE | -- | |
| 凝胶成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| 特异性引物 | TaKaRa | -- | |
| 动物实验 | 西洛他唑 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TAO模型建立 | 大鼠品系、体重、麻醉剂量、月桂酸钠浓度和体积、注射部位及血流阻断时间 阅读提示:Materials and methods - Grouping of rats and establishment of the TAO model |
| 分组与给药 | 分组数量、每组样本量、BF剂量(3.85、7.71、15.42 g/kg)、Cilostazol剂量(68.6 mg/kg)、给药途径和持续时间 阅读提示:Materials and methods - Grouping of rats and establishment of the TAO model |
| 血浆细胞因子检测 | ELISA试剂盒品牌和货号、血浆处理方法、检测指标 阅读提示:Materials and methods - Analysis of cytokines in the plasma using ELISA |
| Western blot | 抗体品牌和货号、稀释比例、蛋白提取方法、内参设置 阅读提示:Materials and methods - Western blotting |
| RT-qPCR | 引物序列、PCR参数、内参基因、RNA提取方法 阅读提示:Materials and methods - Analysis of mRNA expression using quantitative RT-PCR |