益生菌补充通过改善线粒体功能和能量代谢促进6-OHDA诱导的运动缺陷恢复

Probiotic Supplementation Facilitates Recovery of 6-OHDA-Induced Motor Deficit via Improving Mitochondrial Function and Energy Metabolism.

作者信息Bira Arumndari Nurrahma, Shu-Ping Tsao, Chieh-Hsi Wu, Tu-Hsueh Yeh, Pei-Shan Hsieh, Binar Panunggal, Hui-Yu Huang
PMID34025392
发布时间2021-05-07
DOI10.3389/fnagi.2021.668775

实验完整度

研究包含动物模型(6-OHDA诱导PD大鼠)、功能验证(旋转、步态测试)、机制验证(线粒体功能、抗氧化酶、SCFAs)以及生化分析(血清生化)。实验分组对照明确(NC、PD、L、AP-32、RM、A-RM)。

主要模型

单侧6-OHDA诱导的帕金森病大鼠模型 (Sprague-Dawley) L-多巴处理的帕金森病大鼠模型

重点核对

6-OHDA注射剂量:9 μg/rat,注射于右侧内侧前脑束(MFB),坐标AP −4.4 mm, ML 1.2 mm, DV −7.8 mm 补充剂剂量:AP-32 1.03 × 10^9 CFU/kgBW, RM 62 mg/kgBW,每日灌胃,持续8周 L-DOPA治疗剂量:8 mg/kgBW L-DOPA + 15 mg/kgBW benserazide,腹腔注射,每周3次,持续8周 阿扑吗啡诱导旋转测试剂量:0.5 mg/kgBW,皮下注射,记录1小时 样本量:每组5只大鼠

摘要

帕金森病(PD)是一种与老年人运动和非运动功能进行性损害相关的神经退行性疾病。大量证据表明,线粒体功能障碍是PD病理生理学的核心因素,它损害能量代谢。然而,其他一些研究表明,益生菌补充剂可以改善宿主能量代谢,减轻疾病进展,预防肠道菌群失调,并改变共生细菌代谢物。但是,益生菌和/或益生元补充剂是否能影响能量代谢并导致PD进展受阻,这一点仍未得到很好的表征。因此,我们研究了益生菌[唾液乳杆菌亚种盐杆菌AP-32(AP-32)]、从AP-32培养基中获得的残余培养基(RM)以及AP-32和RM的组合(A-RM)对单侧6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的PD大鼠8周补充的影响。我们发现,AP-32、RM和A-RM补充对多巴胺能神经元产生神经保护作用,并改善PD大鼠的运动功能。这些效应伴随着脑和肌肉线粒体活性的显著增加、血清抗氧化酶水平的升高以及粪便样本中短链脂肪酸谱的改变。重要的是,AP-32补充恢复了PD大鼠的肌肉质量并改善了运动功能,并且在补充剂中产生了最好的结果。我们的结果表明,益生菌AP-32和A-RM补充可以通过增加短链脂肪酸的产生和线粒体功能来恢复能量代谢。脑和肌肉中线粒体功能的恢复以及能量代谢的改善可能还通过抗氧化剂产生的增加抑制活性氧,从而进一步增强,最终促进6-OHDA诱导的运动缺陷的恢复。总之,这项工作表明,益生菌AP-32补充可能是预防PD进展的替代治疗策略的潜在候选者。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
益生菌AP-32、残余培养基RM及其组合A-RM的补充能否通过改善能量代谢和线粒体功能来预防6-OHDA诱导的PD大鼠神经退行性变和运动缺陷?
核心机制
AP-32、RM和A-RM可能通过增加短链脂肪酸产生和线粒体功能,增强脑和肌肉的能量代谢,同时通过增加抗氧化酶(SOD、GPx)活性抑制活性氧,从而保护多巴胺能神经元并改善运动功能。
主要证据
在6-OHDA诱导的PD大鼠模型中,AP-32、RM和A-RM补充显著减少了多巴胺能神经元死亡(TH免疫组化),改善了运动功能(阿扑吗啡诱导旋转测试和Catwalk步态分析),并提高了脑和肌肉的线粒体功能(Seahorse分析)、血清抗氧化酶活性(GPx、SOD)以及粪便短链脂肪酸水平(HPLC)。
研究意义
作者提出AP-32补充可作为预防PD进展的潜在替代治疗策略,但需要更多研究来阐明其机制。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

PD模型建立

通过单侧6-OHDA注射建立帕金森病大鼠模型,模拟PD病理特征。

雄性SD大鼠在右侧MFB注射6-OHDA(9 μg/3 μl)诱导PD,术后6周通过阿扑吗啡诱导旋转测试确认模型成功(对侧旋转>100次/小时)。

2

补充剂干预

评估AP-32、RM和A-RM长期补充对PD进展的影响。

PD大鼠随机分为5组,分别接受AP-32、RM、A-RM灌胃或L-DOPA腹腔注射,持续8周。

3

行为学评估

评价补充剂对PD大鼠运动功能的影响。

在补充4周和8周时进行阿扑吗啡诱导旋转测试,8周后进行Catwalk步态分析。

4

组织学分析

评估多巴胺能神经元存活情况。

通过免疫组化染色检测纹状体和黑质致密部的酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞。

5

线粒体功能检测

评估补充剂对脑和肌肉线粒体功能的影响。

使用Seahorse XFe24分析脑和比目鱼肌的基线耗氧率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)。

6

生化分析

评估血清生化指标、抗氧化酶活性和粪便短链脂肪酸水平。

使用自动分析仪检测血清生化指标,使用试剂盒检测GPx和SOD活性,使用HPLC检测粪便SCFAs。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
6-羟基多巴胺Sigma-Aldrich9
抗坏血酸----
汉密尔顿注射器--10
抗酪氨酸羟化酶抗体ElabscienceE-AB-70077
山羊抗兔IgG-HRPSigmaB7401
DAB底物试剂盒Vector--
Permount封片剂Fisher Scientific--
Seahorse XFe24细胞外流量分析仪Seahorse Bioscience--
XFe24胰岛捕获微板Seahorse Bioscience101122-100
XF校准液Seahorse Bioscience100867-000
Seahorse XF检测培养基Seahorse Bioscience102365-100
Bradford蛋白定量试剂Thermo Scientific--
牛血清白蛋白Sigma-Aldrich--
谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒BioVision--
超氧化物歧化酶检测试剂盒BioVision--
富士NX500i自动分析仪FujifilmNX500i
GaitLab ViewPoint步态分析系统ViewPoint--
双能X线吸收仪Lunar Hologic, GE Healthcare--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
PD模型建立
6-OHDA剂量、注射坐标、注射速度,以及模型成功标准(对侧旋转>100次/小时)
阅读提示:参见Materials and Methods中的Unilateral 6-OHDA Injection Into the Right MFB和Animal Grouping
补充剂干预
AP-32、RM、A-RM的剂量、给药途径(口服灌胃)、频率(每天)和持续时间(8周);L-DOPA的剂量、给药途径(腹腔注射)、频率(每周3次)和持续时间
阅读提示:参见Materials and Methods中的Animal Grouping
行为学评估
阿扑吗啡剂量(0.5 mg/kgBW)、给药途径(皮下)、旋转记录时间(1小时);Catwalk步态分析的参数设置(如速度、步长等)
阅读提示:参见Materials and Methods中的Apomorphine-Induced Rotation Test和Catwalk Quantitative Gait Analysis Test
组织学分析
脑切片位置(纹状体、SNc)、一抗稀释度(1:300)、二抗稀释度(1:100)、孵育时间和温度
阅读提示:参见Materials and Methods中的Immunohistochemistry Staining and Image Analysis
线粒体功能检测
组织来源(脑、比目鱼肌)、培养基成分(葡萄糖5.0 mM、丙酮酸2.0 mM)、OCR和ECAR的测量条件
阅读提示:参见Materials and Methods中的Mitochondrial Function by Seahorse Bioscience XFe24 Extracellular Flux Analysis