建立AH小鼠模型并评估肝损伤
验证AH模型是否成功诱导，并观察GSDMD通路激活情况。
通过酒精灌胃建立AH小鼠模型，HE染色观察肝组织损伤，检测血清AST、ALT、TC、TG水平，并检测肝组织中GSDMD-N、NLRP3、Caspase 11表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
GSDMD通过调节线粒体功能障碍诱导肝细胞焦亡触发酒精性肝炎
GSDMD induces hepatocyte pyroptosis to trigger alcoholic hepatitis through modulating mitochondrial dysfunction.
实验完整度
高包含体内小鼠模型（AH模型、shRNA敲低）、体外细胞实验（LO2细胞、药物抑制、shRNA）及分子检测（western blot、qPCR、ELISA等），并进行了功能验证（GSDMD敲低）和机制验证（Drp1抑制）。
主要模型
C57BL/6小鼠酒精性肝炎模型 人肝细胞系LO2
重点核对
乙醇浓度40%，处理48小时 Mdivi1浓度10μM，预处理12小时 GSDMD或Drp1敲低（shRNA） 使用酒精灌胃诱导AH小鼠模型 每组6只小鼠
摘要
背景：Gasdermin D（GSDMD）在酒精性肝炎（AH）中激活的机制和后果尚不清楚。在本研究中，我们研究了GSDMD是否通过调节AH中的线粒体功能障碍来诱导肝细胞焦亡。结果：通过HE染色、血清AST、ALT、TC和TG水平评估AH小鼠的肝损伤。通过检测IL-1β、IL-18、LDH、炎症小体相关蛋白和肝细胞死亡的水平来确定焦亡。通过包括线粒体DNA（mtDNA）水平、ROS产生、线粒体膜电位、ATP含量、线粒体功能相关蛋白水平和线粒体形态变化在内的多个参数评估线粒体功能障碍。AH诱导Gasdermin D（GSDMD）激活，导致肝组织中N端GSDMD（GSDMD-N）、NLRP3和Caspase 11蛋白表达增加。下调GSDMD减轻了酒精诱导的肝细胞焦亡。酒精还导致AH中肝细胞线粒体功能障碍，而抑制GSDMD可改善这种情况。此外，增强线粒体功能抑制了酒精诱导的肝细胞焦亡。此外，敲低GSDMD或发动蛋白相关蛋白1（Drp1）改善了AH诱导的肝损伤，并伴随肝细胞焦亡减少。结论：GSDMD通过在AH诱导的炎症和肝损伤中调节线粒体功能障碍来诱导肝细胞焦亡。这些发现可能为开发AH的新治疗方法铺平道路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- GSDMD在酒精性肝炎中是否通过调节线粒体功能障碍诱导肝细胞焦亡？
- 核心机制
- 酒精诱导GSDMD激活，GSDMD-N转位至线粒体导致线粒体功能障碍，产生ROS，激活NLRP3炎症小体和Caspase-1，进而促进肝细胞焦亡。
- 主要证据
- AH小鼠模型中GSDMD-N、NLRP3、Caspase 11表达升高；体外敲低GSDMD改善线粒体功能障碍并减少焦亡；抑制Drp1（Mdivi1）改善线粒体功能并抑制焦亡；体内敲低GSDMD或Drp1减轻肝损伤和线粒体损伤。
- 研究意义
- 揭示了GSDMD介导线粒体功能障碍在AH中的新机制，为开发AH新疗法（如GSDMD阻断剂）提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外敲低GSDMD验证其对肝细胞焦亡的影响
确定GSDMD是否介导酒精诱导的肝细胞焦亡。
在LO2细胞中转染sh-GSDMD或sh-NC，然后用酒精处理，检测GSDMD表达、焦亡标志物（IL-1β、IL-18、LDH、PI染色）及炎症小体蛋白表达。
检测AH中肝细胞线粒体功能障碍
评估AH是否导致肝细胞线粒体功能障碍。
检测AH小鼠肝组织中ND1、ND2基因表达，ATP水平，线粒体融合/分裂蛋白（Mfn1、Mfn2、Opa1、Drp1、Fis1）表达，以及TEM观察线粒体形态。
体外敲低GSDMD验证其对线粒体功能障碍的影响
确定GSDMD敲低是否能改善酒精诱导的肝细胞线粒体功能障碍。
在LO2细胞中转染sh-GSDMD后酒精处理，检测ROS、mtDNA（ND1/ND2）、ATP、线粒体膜电位及线粒体融合/分裂蛋白表达。
使用Drp1抑制剂Mdivi1验证改善线粒体功能对焦亡的影响
验证改善线粒体功能障碍是否能抑制酒精诱导的肝细胞焦亡。
用Mdivi1预处理LO2细胞，然后酒精处理，检测线粒体功能指标和焦亡相关指标。
体内敲低GSDMD或Drp1验证其在AH中的作用
验证GSDMD和Drp1在体内对AH肝损伤和线粒体功能障碍的作用。
通过尾静脉注射sh-GSDMD或sh-Drp1慢病毒，然后建立AH模型，评估肝损伤、焦亡指标和线粒体功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | F12 DMEM培养基 | ATCC | 30-2006 |
| 胎牛血清 | ATCC | 30-2020 | |
| Western blot | ASC抗体 | Affinity Biosciences | DF6304 |
| cleaved Caspase 1抗体 | Affinity Biosciences | AF4005 | |
| 线粒体融合蛋白1抗体 | Affinity Biosciences | DF7543 | |
| pro-IL-1β抗体 | Affinity Biosciences | AF5103 | |
| 线粒体融合蛋白2抗体 | Affinity Biosciences | DF8106 | |
| 视神经萎缩蛋白1抗体 | Affinity Biosciences | DF8587 | |
| 发动蛋白相关蛋白1抗体 | Affinity Biosciences | DF7037 | |
| 线粒体裂变蛋白1抗体 | Affinity Biosciences | DF12005 | |
| N端GSDMD抗体 | Affinity Biosciences | DF12275 | |
| N端GSDMD抗体 | Affinity Biosciences | DF13758 | |
| COX IV抗体 | Affinity Biosciences | AF5468 | |
| GAPDH抗体 | Affinity Biosciences | AF7021 | |
| Caspase 11抗体 | Novus Biologicals | NB120-10454 | |
| NLRP3抗体 | Novus Biologicals | NBP2-12446 | |
| 山羊抗兔二抗 | Affinity Biosciences | S0001 | |
| 山羊抗小鼠二抗 | Affinity Biosciences | S0002 | |
| 山羊抗大鼠二抗 | Abcam | ab97057 | |
| 药物处理 | Mdivi1 | Sigma | #34667 |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| GSDMD shRNA质粒 | Sangon Biotechnology | -- | |
| Drp1 shRNA质粒 | Sangon Biotechnology | -- | |
| 阴性对照shRNA | Sangon Biotechnology | -- | |
| 细胞死亡检测 | Hoechst荧光核酸染料 | ImmunoChemistry technology | 33342 |
| 生化检测 | AST检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- |
| ALT检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| TC检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| TG检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | -- | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| RNA提取 | RNeasy小型试剂盒 | Qiagen | -- |
| 逆转录 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| qPCR | TB Green Premix Ex Taq | TaKaRa Bio, Inc. | -- |
| Step One Plus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂 | Sigma | P8340 |
| ABC蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | 5000002 | |
| 硝酸纤维素膜 | Invitrogen | -- | |
| ELISA | LDH ELISA试剂盒 | mlbio | ml003416 |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Abcam | ab100704 | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Abcam | ab46052 | |
| IL-18 ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co., Ltd | E-EL-M0730c | |
| IL-18 ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co., Ltd | E-EL-H0253c | |
| 细胞死亡检测 | Hoechst 33342/PI双染色试剂盒 | Roche | -- |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1染色试剂盒 | Beyotime | C2006 |
| ROS检测 | ROS检测试剂盒 | Beyotime | S0033S |
| ATP检测 | ATP比色法检测试剂盒 | Beyotime | S0026 |
| TEM | 透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| ROS检测 | 酶标仪 | BioTek | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AH小鼠模型诱导 | 小鼠品系、年龄、性别；饮食方案（高胆固醇高脂饮食、乙醇高脂饮食）；酒精灌胃浓度和递增方案；造模周期；对照组设置 阅读提示：Methods中Mouse AH model部分，以及Fig.1 legend |
| 细胞培养和处理 | 细胞系LO2；培养基（RPMI-1640+10%FBS+1%青霉素-链霉素）；乙醇浓度（40%）、处理时间（48h）；Mdivi1浓度（10μM）、预处理时间（12h）；细胞接种密度 阅读提示：Methods中Cell culture, treatment and transfection部分 |
| GSDMD/Drp1敲低 | shRNA质粒序列或来源；转染试剂（Lipofectamine 3000）；体内慢病毒注射剂量和途径（尾静脉，100μL）；对照组（sh-NC） 阅读提示：Methods中Cell culture, treatment and transfection和Mouse AH model部分 |
| 线粒体功能检测 | 检测指标（mtDNA ND1/ND2、ROS、ATP、线粒体膜电位、线粒体融合/分裂蛋白）；具体试剂盒和操作步骤；样本量 阅读提示：Methods中Measurement of ROS and ATP levels、Assessment of mitochondrial membrane potential和Western blot部分，以及Fig.3、4、5 legends |
| 肝损伤和焦亡评估 | 血清AST、ALT、TC、TG检测；IL-1β、IL-18、LDH水平；HE染色；PI阳性细胞百分比；统计方法 阅读提示：Methods中Biochemical assays、Hematoxylin and eosin (H&E) dye和Enzyme linked immunosorbent assay部分，以及Fig.1、2、5、6 legends |