建立LPS诱导的鸡胚胎成肌细胞炎症模型
验证LPS能否诱导鸡胚胎成肌细胞产生炎症反应。
在增殖和分化阶段，用500 ng/mL LPS处理细胞0.5和3小时，检测炎症因子TNFα、IL6、IL1β的mRNA和蛋白表达。
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白术多糖缓解脂多糖诱导的鸡胚胎成肌细胞增殖、分化抑制及过度凋亡
Polysaccharide of Atractylodes macrocephala Koidz alleviates LPS-induced proliferation, differentiation inhibition and excessive apoptosis in chicken embryonic myogenic cells.
实验完整度
中包含细胞模型下的炎症、增殖、分化、凋亡检测及Caspase1抑制剂干预，但缺乏动物模型或体内验证。
主要模型
鸡胚胎成肌细胞
重点核对
细胞类型：鸡胚胎成肌细胞 LPS处理浓度：500 ng/mL PAMK处理浓度：15 µg/mL belnacasan处理浓度：40 µM 处理时间：增殖和分化阶段处理24 h
摘要
背景：脂多糖（LPS）可诱发全身性炎症反应并影响家禽的生长发育。作为一种中药，白术多糖（PAMK）能有效改善动物的生长性能并提高动物机体的免疫力。目的：本研究旨在探讨PAMK对LPS诱导的鸡胚胎成肌细胞炎症反应、增殖、分化及凋亡的影响。方法：以鸡胚胎成肌细胞为模型，通过检测EdU/MYHC免疫荧光、炎症、增殖、分化相关基因和蛋白的表达以及凋亡细胞的数量，在添加LPS、PAMK、belnacasan（一种Caspase1抑制剂）或其组合的条件下。结果：结果表明，LPS刺激增加了炎症因子的表达，抑制了鸡胚胎成肌细胞的增殖和分化，并导致过度凋亡，而PAMK缓解了LPS引起的这些不良影响。添加belnacasan（Caspase1抑制剂）后，成肌细胞的凋亡受到抑制，因此凋亡细胞的数量以及促凋亡基因Caspase1和Caspase3的表达增加。此外，belnacasan抑制了LPS诱导的鸡胚胎成肌细胞炎症因子表达增加、增殖抑制、分化抑制和过度凋亡。结论：本研究为进一步探讨PAMK和外源性LPS对鸡胚胎成肌细胞的作用机制提供了理论依据，并为畜牧业绿色饲料添加剂的开发和应用奠定了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PAMK能否缓解LPS诱导的鸡胚胎成肌细胞炎症反应、增殖抑制、分化抑制和过度凋亡？
- 核心机制
- PAMK通过抑制炎症因子的表达、促进增殖和分化相关基因（如MyoD、MYHC）的表达、抑制凋亡相关基因Caspase1和Caspase3的表达并上调Bcl2，从而缓解LPS诱导的不良效应。
- 主要证据
- 使用鸡胚胎成肌细胞，通过EdU、MYHC免疫荧光、RT-qPCR、Western blot和流式细胞术检测，发现PAMK能降低LPS诱导的炎症因子表达、提高细胞增殖和分化能力、减少凋亡细胞数量。
- 研究意义
- 为通过饲料添加PAMK改善家禽生长性能提供理论依据，并为绿色饲料添加剂的开发奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PAMK处理缓解LPS诱导的炎症反应
评估PAMK对LPS诱导的炎症反应的缓解作用。
在LPS存在或不存在的情况下，用15 µg/mL PAMK处理细胞，检测炎症因子的表达。
检测细胞增殖能力
确定LPS和PAMK对细胞增殖的影响。
通过EdU实验和增殖相关基因表达检测，评估处理后24小时的细胞增殖能力。
检测细胞分化能力
评估LPS和PAMK对肌管分化的影响。
通过MYHC免疫荧光和分化相关基因表达检测，评估处理后24小时的分化程度。
检测细胞凋亡
评估LPS和PAMK对细胞凋亡的影响。
通过流式细胞术和凋亡相关基因表达检测，评估处理后24小时的凋亡细胞比例。
Caspase1抑制剂干预
探讨凋亡途径在LPS诱导效应中的作用。
使用40 µM belnacasan预处理细胞，结合LPS和PAMK处理，检测上述各项指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 青霉素-链霉素 | Gibco | -- |
| 磷酸盐缓冲液 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | -- | |
| DMEM-F12培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 马血清 | Sigma | -- | |
| 药物处理 | 白术多糖 | 西安天源生物制剂厂 | -- |
| 脂多糖 | -- | -- | |
| 贝那卡桑 | MCE | -- | |
| EdU实验 | EdU试剂盒 | RiboBio | C10310-3 |
| Hoechst 33342 | -- | -- | |
| 荧光显微镜 | 倒置荧光显微镜 | Olympus | IX73P1F |
| RT-qPCR | 逆转录试剂盒 | TOYOBO | FSQ-301 |
| Light Cycler 480 II | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 7 Flex | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 脱脂牛奶 | -- | -- | |
| IL6抗体 | Abcam | ab9324 | |
| TNFα抗体 | Wanlei | WL01581 | |
| MyoD抗体 | Abcam | ab16148 | |
| MYHC抗体 | Sigma | M4276 | |
| MSTN抗体 | Abcam | ab9324 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | ab181602 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Abcam | ab181602 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Wanlei | WLA023a | |
| Tanon 5200 Multi | Tanon | -- | |
| 流式细胞术 | 凋亡检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-A211 |
| FITC-膜联蛋白V | -- | -- | |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| BD Accuri C6流式细胞仪 | BD | -- | |
| 统计分析 | SPSS 24.0 | -- | -- |
| GraphPad Prism 7.0 | -- | -- | |
| 图像分析 | Image-Pro Plus 6.0 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞分离与培养 | 鸡胚胎日龄、肌肉组织来源、消化酶浓度和消化时间、培养温度、CO2浓度、血清浓度和类型 阅读提示：Materials and Methods, section 2.1 |
| 药物处理 | LPS浓度（500 ng/mL）、PAMK浓度（15 µg/mL）、belnacasan浓度（40 µM）、处理时间（0.5、3、24 h）、处理分组 阅读提示：Materials and Methods, section 2.2 |
| EdU增殖实验 | EdU孵育时间（2 h）、固定液和透化液浓度、染色时间、阳性率统计标准 阅读提示：Materials and Methods, section 2.3 |
| RT-qPCR | 引物序列、退火温度（60°C）、循环数（40）、内参基因（GAPDH）、检测时间点 阅读提示：Materials and Methods, section 2.4 and Table 1 |
| Western blot | 抗体稀释度、电泳条件（80V/15min, 100V/60min）、转膜电流（200A）、封闭条件、曝光设备 阅读提示：Materials and Methods, section 2.5 |
| 流式凋亡检测 | 细胞数量（0.2-1.0×10^6）、Annexin V和PI孵育时间、上机时间（1h内）、补偿设置 阅读提示：Materials and Methods, section 2.6 |
| 统计分析 | 统计方法（双因素方差分析）、相对定量方法（2^-ΔΔCt）、显著性标准（p<0.05） 阅读提示：Materials and Methods, section 2.7 |