建立急性睾丸缺血-再灌注损伤模型及细胞移植
评估SLCs和BMSCs对急性损伤后睾丸结构和功能的修复作用。
建立小鼠睾丸扭转模型，将BMSCs或SLCs移植入睾丸间质，28天后检测睾丸重量、组织学、生精细胞、精子参数和生育力。
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小鼠中，干细胞样Leydig细胞通过线粒体转移支持巨噬细胞免疫稳态。
Stem Leydig cells support macrophage immunological homeostasis through mitochondrial transfer in mice.
实验完整度
高包含体外共培养、体内移植、TRPM7敲低、老化模型等多层级验证，且有功能（生育力、睾酮）和机制（线粒体转移、ROS）验证。
主要模型
小鼠睾丸缺血-再灌注（扭转）模型 小鼠睾丸老化模型 原代小鼠SLCs 原代小鼠巨噬细胞
重点核对
SLCs和巨噬细胞的共培养比例、时间和标记（MitoTracker Red CMXRos、CellTrace Violet） 移植细胞数量（1×10^6）和注射体积（20 μL生理盐水） TRPM7敲低方法（shRNA慢病毒）及验证（Western blot） 缺血-再灌注模型的建立（720°扭转1小时）
摘要
作为睾丸间充质基质细胞，干细胞样Leydig细胞（SLCs）在治疗男性性腺功能减退方面显示出巨大潜力。间充质基质细胞的治疗功能在很大程度上取决于其与免疫反应的相互调节。然而，SLCs的免疫调节特性仍不清楚。在此，我们观察到SLCs移植在缺血-再灌注损伤小鼠模型中恢复男性生育能力和睾酮产生。SLCs通过线粒体转移至巨噬细胞来阻止炎症级联反应。活化的巨噬细胞释放的活性氧（ROS）以瞬时受体电位阳离子通道亚家族成员7（TRPM7）介导的方式诱导线粒体从SLCs转移至巨噬细胞。值得注意的是，移植的SLCs中TRPM7的敲低在睾丸缺血-再灌注和睾丸老化小鼠模型中都损害了治疗效果。这些发现揭示了SLCs移植的一种新机制，可能有助于保留患有与免疫紊乱相关的性腺功能减退的男性患者的睾丸功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SLCs是否具有免疫调节功能及其机制，尤其是在急性损伤和老化条件下如何通过调节巨噬细胞来恢复睾丸功能？
- 核心机制
- 活化的巨噬细胞释放ROS，通过TRPM7介导的方式诱导SLCs通过纳米管将线粒体转移至巨噬细胞，从而抑制促炎反应，促进M2极化，重塑免疫微环境，进而促进Leydig细胞再生和生精功能恢复。
- 主要证据
- 在睾丸扭转和老化模型中，SLCs移植改善生育力、精子和睾酮水平；共培养和体内实验证明线粒体转移；TRPM7敲低减少转移并降低治疗效果。
- 研究意义
- 揭示了SLCs移植治疗男性免疫相关不育的新机制，为SLCs细胞治疗或可能的无细胞治疗提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估移植细胞对睾酮产生和Leydig细胞再生的影响
确定移植的SLCs是否通过分化成Leydig细胞来恢复睾酮。
测量血清睾酮水平，追踪zsGreen标记的移植细胞，分析其分化情况，并比较内源性Leydig细胞的变化。
验证移植SLCs对早期炎症反应的抑制作用
探究SLCs是否通过抑制免疫反应来保护睾丸。
在移植后1、3、7天检测巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞比例和炎性细胞因子表达。
探索SLCs与巨噬细胞之间的线粒体转移机制
证明SLCs通过纳米管向巨噬细胞转移线粒体。
共培养SLCs和巨噬细胞，使用MitoTracker和Mito-DsRed标记，通过流式、共聚焦和电镜观察线粒体转移。
验证TRPM7在ROS诱导的线粒体转移中的作用
确定TRPM7是否感知ROS并调节线粒体转移。
敲低SLCs中的TRPM7，检测线粒体转移率；用H2O2或NAC处理，观察影响。
评估TRPM7敲低对体内治疗效果的影响
确认TRPM7介导的线粒体转移在体内治疗中的必要性。
将SLCsshTRPM7移植入睾丸扭转和老化模型，28天后检测睾丸功能和组织学。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离与培养 | IV型胶原酶 | Gibco | 17104-019 |
| DMEM/F12培养基 | Gibco | 11320033 | |
| 胎牛血清 | VISTECH | SE100-011 | |
| 地塞米松 | Sigma | D4902 | |
| 白血病抑制因子 | Sigma | LIF2005 | |
| 鸡胚提取物 | US Biologicals | C3999 | |
| β-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | 11140050 | |
| N2添加剂 | Gibco | 17502001 | |
| B27添加剂 | Gibco | 17504044 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Invitrogen | RFGFB50 | |
| 表皮生长因子 | PeproTech | 31509 | |
| 血小板衍生生长因子 | PeproTech | 31518 | |
| 抑瘤素M | PeproTech | 30010 | |
| DMEM培养基 | GIBCO | C11885500BT | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 细胞共培养 | MitoTracker Red CMXRos线粒体染料 | Invitrogen | M7512 |
| CellTrace Violet细胞示踪染料 | Invitrogen | C34571 | |
| 荧光显微镜 | Triton X-100 | Beyotime | P0099 |
| 鬼笔环肽-Alexa 488 | Invitrogen | A12379 | |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | |
| 花生凝集素 | Sigma | L7381 | |
| 免疫荧光 | 抗DDX4抗体 | Abcam | ab27591 |
| 抗SYCP3抗体 | Abcam | ab15093 | |
| 抗α-SMA抗体 | Abcam | ab5694 | |
| 抗F4/80抗体 | Abcam | ab6640 | |
| 抗3β-HSD抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 抗CYP11A1抗体 | Cell Signaling | 14217 | |
| 抗肌球蛋白IIa抗体 | Cell Signaling | 49349 | |
| 抗TRPM7抗体 | Affinity | DF7513 | |
| 抗Nestin抗体 | Abcam | ab134107 | |
| 山羊抗小鼠Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150077 | |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 555 | Abcam | ab150078 | |
| 山羊抗大鼠Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150165 | |
| 凋亡检测 | 原位凋亡检测试剂盒 | Roche | 11684795910 |
| 荧光显微镜 | 蔡司LSM 800共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Fisher Scientific | 15596018 |
| 2×PCR预混液 | GenStar | A301-10 | |
| Light Cycler 480检测系统 | Roche | -- | |
| 流式细胞术 | CD51-BV421抗体 | BD Bioscience | 740062 |
| F4/80-BV421抗体 | BioLegend | 123137 | |
| CD45-PE/CY7抗体 | BioLegend | 103113 | |
| CD11b-FITC抗体 | BioLegend | 101205 | |
| Ly6C-APC抗体 | BioLegend | 128015 | |
| Ly6G-APC抗体 | BioLegend | 127613 | |
| CD86-FITC抗体 | BioLegend | 105109 | |
| CD206-FITC抗体 | BioLegend | 141703 | |
| Agr1-PE抗体 | R&D Systems | IC5868P | |
| INOS-PE抗体 | BioLegend | 128015 | |
| 抗LHR抗体 | Alomone labs | ALR-010 | |
| 驴抗兔IgG-PE | BioLegend | 406421 | |
| 凋亡检测 | Annexin V-APC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-A217 |
| 流式细胞术 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Scientific | 89900 |
| 磷酸酶抑制剂 | Merck | 524629 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | |
| 硝酸纤维素膜 | Millipore | -- | |
| 抗微管蛋白抗体 | Abcam | ab59680 | |
| 抗小鼠HRP | ZSJB-BIO | zb2305 | |
| 抗兔HRP | ZSJB-BIO | zb2301 | |
| ECL试剂盒 | Yeasen | 36208ES60 | |
| 线粒体ROS和膜电位测量 | MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 |
| TMRM | Invitrogen | T668 | |
| 慢病毒转导 | pCMV-Mito-DsRed-puro慢病毒颗粒 | Hanbio Tech | -- |
| TRPM7 shRNA慢病毒颗粒 | Hanbio Biotechnology | -- | |
| 基因递送 | AAV8-shTRPM7载体 | Beijing Tsingke Biotech Co., Ltd. | TST20230904-020-00001 |
| 33号针头注射器 | Hamilton | -- | |
| 质谱分析 | BCA定量试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Fisher Scientific | 15596018 |
| NucleoSpin RNA XS提取试剂盒 | Takara Bio | U0902A | |
| Qubit 2.0荧光计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TruSeq链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| NextSeq 500/550测序平台 | Illumina | -- | |
| 精子检测 | M2培养基 | Sigma | M7167 |
| 体外受精 | 孕马血清促性腺激素 | NSHF | -- |
| 人绒毛膜促性腺激素 | NSHF | -- | |
| HTF培养基 | Easy Check | M1130 | |
| 矿物油 | Sigma-Aldrich | M5310 | |
| KSOM培养基 | Easy Check | M1430 | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 9软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建 | 小鼠品系、周龄（C57BL/6J，8-10周龄）、扭转角度和时间（720°，1小时）、细胞注射剂量（1×10^6个细胞/20 μL） 阅读提示：Methods: Animals |
| 细胞分离与培养 | SLCs分离方法（CD51+分选）、培养条件（培养基组成）、BMSCs分离方法 阅读提示：Methods: Cell isolation and culture |
| 共培养实验 | 共培养比例（1:1）、时间（24小时）、标记物（MitoTracker Red CMXRos、CellTrace Violet） 阅读提示：Methods: Coculture of macrophages with BMSCs or SLCs |
| TRPM7敲低 | shRNA序列、慢病毒转导方法、敲低效率验证（Western blot） 阅读提示：Methods: Lentiviral vector transduction |
| 体内验证 | 移植细胞类型、数量、时间点（24小时、28天）、检测指标（睾丸重量、组织学、精子参数、睾酮水平） 阅读提示：Methods: Animals; Results: Figures 5 and 6 |