CS-Neus的制备与表征
验证冷冻休克处理能否使中性粒细胞死亡并保留其细胞结构和功能。
将中性粒细胞悬浮于非程序性细胞冷冻保存液中,直接浸入液氮12小时获得CS-Neus;通过荧光染色、流式细胞术、SEM、CCK-8、ELISA等检测细胞活力、形态、受体表达和细胞因子释放能力。
Autologous cryo-shocked neutrophils enable targeted therapy of sepsis via broad-spectrum neutralization of pro-inflammatory cytokines and endotoxins.
研究包含体外细胞实验(细胞活力、受体表达、趋化、中和能力)、体内小鼠模型(LPS诱导脓毒症,治疗及生存分析)及临床患者样本验证,且包含功能验证和机制验证。
LPS诱导的脓毒症小鼠模型 人外周血中性粒细胞 小鼠中性粒细胞 小鼠巨噬细胞RAW264.7 人脐静脉内皮细胞HUVEC 小鼠成纤维细胞L929
CS-Neus的制备:液氮浸泡12小时 LPS诱导脓毒症模型:腹腔注射LPS 30 mg/kg 治疗剂量:静脉注射9.0 × 10^6个CS-Neus或活中性粒细胞,于2、4、6小时 体内分布:静脉注射DiI标记的CS-Neus 200 μL (2.0 × 10^7 count/mL) 临床样本:脓毒症患者血浆与自体CS-Neus共孵育30分钟
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证冷冻休克处理能否使中性粒细胞死亡并保留其细胞结构和功能。
将中性粒细胞悬浮于非程序性细胞冷冻保存液中,直接浸入液氮12小时获得CS-Neus;通过荧光染色、流式细胞术、SEM、CCK-8、ELISA等检测细胞活力、形态、受体表达和细胞因子释放能力。
评估CS-Neus对正常细胞和健康小鼠的生物相容性和免疫排斥风险。
将CS-Neus与HUVEC和L929细胞共孵育,检测细胞活力;静脉注射高浓度CS-Neus至健康小鼠,检测血常规、血浆生化、组织病理和体重变化;与人红细胞共孵育检测溶血。
验证CS-Neus是否保留炎症趋化性、广谱中和促炎细胞因子和清除内毒素的能力。
通过Western blot检测受体表达;使用transwell实验检测趋化性;通过共孵育实验检测CS-Neus对IL-1β、IL-6、TNF-α和LPS的中和/清除效率。
评估CS-Neus在脓毒症小鼠模型中的靶向能力和治疗效果。
建立LPS诱导的脓毒症小鼠模型,静脉注射DiI标记的CS-Neus观察其组织分布;在2、4、6小时给予活Neus或CS-Neus治疗,检测肺组织炎症因子、组织病理、体温和生存率。
验证CS-Neus在体内的清除途径及在临床样本中的抗炎效果。
将DiI标记的CS-Neus与巨噬细胞共孵育观察吞噬和降解;分离脓毒症患者外周血中性粒细胞制备自体CS-Neus,与患者血浆共孵育,检测细胞因子水平。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞冷冻 | NCR细胞冷冻保存液 | Cyagen | -- |
| 细胞核染色 | Hoechst染料 | Invitrogen | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco Life Technologies | -- |
| 胎牛血清 | Gibco Life Technologies | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco Life Technologies | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco Life Technologies | -- | |
| 细胞膜染色 | 细胞膜红色荧光染色试剂盒(DiI) | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd. | AC11038 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解缓冲液 | APExBIO | K1120 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白浓度测定试剂盒 | KeyGEN Biotech | -- |
| 细胞活力检测 | Calcein/PI细胞活力/细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 蛋白染色 | 考马斯亮蓝 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 趋化实验 | 重组鼠MIP-2/CXCL2 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 中性粒细胞分离 | 中性粒细胞分离试剂盒 | Beijing Solarbio Science and Technology Co., Ltd. | P9040 |
| 细胞增殖检测 | 细胞增殖检测试剂盒(CCK-8) | Beijing Solarbio Science and Technology Co., Ltd. | -- |
| 溶剂 | 二甲基亚砜 | Beijing Solarbio Science and Technology Co., Ltd. | -- |
| Western blot | 兔抗人IL-1R2抗体 | Abcam | -- |
| 兔抗人TNFR1抗体 | Abcam | -- | |
| 兔抗人CXCR2抗体 | Abcam | -- | |
| 兔抗人TLR4抗体 | Abcam | -- | |
| 兔抗人IL-6Rα抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗兔IgG二抗 | Proteintech | -- | |
| 山羊抗兔IgG-Fc二抗(HRP) | Beijing Sino Biological Inc. | SSA003 | |
| 山羊抗兔IgG(H+L) | Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | E-AB-1010 | |
| ELISA | 小鼠和人TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA试剂盒 | Dakewe Biotech Co., Ltd. | -- |
| 内毒素检测 | Pierce显色内毒素定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 仪器 | 扫描电子显微镜 | Olympus | FV1200 |
| 荧光显微镜 | Olympus | IX73 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Nikon | A1+ | |
| Western blot | Mini-PROTEAN Tetra电泳系统 | Bio-Rad | -- |
| Western blot成像 | 蛋白质印迹成像系统 | Amersham | ImageQuant 800 |
| 微板阅读器 | 酶标仪 | Bio-Rad | iMark |
| 活体成像 | AniView600多模态活体动物成像系统 | Biolight | -- |
| 蛋白上样缓冲液 | 蛋白上样缓冲液 | Coolaber | -- |
| 预制胶 | 预制胶 | GenScript | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CS-Neus制备 | 中性粒细胞来源(人外周血或小鼠血液/脾脏)、细胞密度、液氮处理时间 阅读提示:Methods 4.6 |
| 脓毒症模型 | LPS剂量(30 mg/kg)、给药途径(腹腔注射)、小鼠品系(ICR)、性别(雌性)、周龄(8周) 阅读提示:Methods 4.12 |
| 治疗实验 | 治疗时间点(2, 4, 6小时)、细胞剂量(9.0 × 10^6 counts)、给药方式(静脉注射)、对照组(未治疗、活Neus) 阅读提示:Methods 4.14 |
| 体外中和实验 | 细胞因子初始浓度(TNF-α 600 pg/mL、IL-6 100 pg/mL、IL-1β 400 pg/mL)、CS-Neus浓度梯度、孵育时间(6小时)、温度(37°C) 阅读提示:Methods 4.11 |
| 临床样本实验 | 脓毒症患者血浆来源、CS-Neus浓度(1.0 × 10^7 count/mL)、孵育时间(30分钟)、温度(37°C) 阅读提示:Methods 4.11 |