自体冷冻休克中性粒细胞通过广谱中和促炎细胞因子和内毒素实现脓毒症的靶向治疗

Autologous cryo-shocked neutrophils enable targeted therapy of sepsis via broad-spectrum neutralization of pro-inflammatory cytokines and endotoxins.

作者信息Qiuxia Gao, Yan Yan, Jie Zhang, Xiaoxue Li, Jiamei Wang, Yi Feng, Peiran Li, Huanhuan Wang, Yunlong Zhang, Lingjie He, Zhiyan Shan, Bin Li
PMID38449477
发布时间2024-02-21
DOI10.3389/fchem.2024.1359946

实验完整度

研究包含体外细胞实验(细胞活力、受体表达、趋化、中和能力)、体内小鼠模型(LPS诱导脓毒症,治疗及生存分析)及临床患者样本验证,且包含功能验证和机制验证。

主要模型

LPS诱导的脓毒症小鼠模型 人外周血中性粒细胞 小鼠中性粒细胞 小鼠巨噬细胞RAW264.7 人脐静脉内皮细胞HUVEC 小鼠成纤维细胞L929

重点核对

CS-Neus的制备:液氮浸泡12小时 LPS诱导脓毒症模型:腹腔注射LPS 30 mg/kg 治疗剂量:静脉注射9.0 × 10^6个CS-Neus或活中性粒细胞,于2、4、6小时 体内分布:静脉注射DiI标记的CS-Neus 200 μL (2.0 × 10^7 count/mL) 临床样本:脓毒症患者血浆与自体CS-Neus共孵育30分钟

摘要

背景:脓毒症是一种危及生命的疾病,其特征是由于炎症反应过度激活和细胞因子风暴导致多器官衰竭。尽管近年来抗细胞因子生物制剂在临床使用中取得了进展,但脓毒症的治疗效果和死亡率的改善仍不理想,这主要是由于免疫调节和细胞因子相互作用的机制复杂性。方法:在这项研究中,基于自体“冷冻休克”中性粒细胞(CS-Neus)开发了一种广谱抗炎和内毒素中和策略用于脓毒症的管理。使用一种新颖的液氮“冷冻休克”策略将中性粒细胞冻死。CS-Neus保留了来源细胞的膜结构和与炎症部位靶向、广谱炎症细胞因子和内毒素(LPS)中和特性相关的功能。该策略旨在消除中性粒细胞的有害促炎功能,如细胞因子分泌。采用自体细胞治疗策略以避免免疫排斥并提高治疗安全性。结果:在LPS诱导的脓毒症小鼠模型和临床患者来源的血样中,CS-Neus治疗通过清除炎症细胞因子和内毒素显著改善了细胞因子风暴。该疗法显示出显著的抗炎治疗效果,并提高了小鼠的存活率。讨论:本研究结果表明,自体“冷冻休克”中性粒细胞作为管理脓毒症的一种有前景的治疗方法具有潜力。通过靶向炎症器官并表现出抗炎活性,CS-Neus为对抗脓毒症治疗的复杂性提供了一种新策略。需要进一步的研究和临床试验来验证这种方法在更广泛人群和环境中的有效性和安全性。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
如何开发一种广谱抗炎和内毒素中和策略,以有效治疗脓毒症并避免传统治疗的局限性?
核心机制
通过冷冻休克使中性粒细胞死亡,保留其细胞膜上的趋化因子受体、促炎细胞因子受体和Toll样受体,从而靶向炎症部位,广谱中和促炎细胞因子和吸附内毒素(LPS)。
主要证据
在LPS诱导的脓毒症小鼠模型中,CS-Neus治疗显著降低了肺组织中的促炎细胞因子(IL-6、TNF-α、IFN-γ)水平,减轻了组织损伤,并提高了小鼠存活率;在临床患者血浆中,CS-Neus显著降低了IL-1β、IL-6和TNF-α浓度。
研究意义
基于自体细胞修饰和回输,避免了免疫排斥和毒副作用,为脓毒症治疗提供了一种新的策略,并为多功能仿生材料的开发提供了平台。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

CS-Neus的制备与表征

验证冷冻休克处理能否使中性粒细胞死亡并保留其细胞结构和功能。

将中性粒细胞悬浮于非程序性细胞冷冻保存液中,直接浸入液氮12小时获得CS-Neus;通过荧光染色、流式细胞术、SEM、CCK-8、ELISA等检测细胞活力、形态、受体表达和细胞因子释放能力。

2

CS-Neus生物安全性评估

评估CS-Neus对正常细胞和健康小鼠的生物相容性和免疫排斥风险。

将CS-Neus与HUVEC和L929细胞共孵育,检测细胞活力;静脉注射高浓度CS-Neus至健康小鼠,检测血常规、血浆生化、组织病理和体重变化;与人红细胞共孵育检测溶血。

3

CS-Neus体外趋化、抗炎和内毒素清除特性

验证CS-Neus是否保留炎症趋化性、广谱中和促炎细胞因子和清除内毒素的能力。

通过Western blot检测受体表达;使用transwell实验检测趋化性;通过共孵育实验检测CS-Neus对IL-1β、IL-6、TNF-α和LPS的中和/清除效率。

4

CS-Neus对脓毒症的靶向治疗作用

评估CS-Neus在脓毒症小鼠模型中的靶向能力和治疗效果。

建立LPS诱导的脓毒症小鼠模型,静脉注射DiI标记的CS-Neus观察其组织分布;在2、4、6小时给予活Neus或CS-Neus治疗,检测肺组织炎症因子、组织病理、体温和生存率。

5

CS-Neus的清除途径和临床应用

验证CS-Neus在体内的清除途径及在临床样本中的抗炎效果。

将DiI标记的CS-Neus与巨噬细胞共孵育观察吞噬和降解;分离脓毒症患者外周血中性粒细胞制备自体CS-Neus,与患者血浆共孵育,检测细胞因子水平。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
脂多糖Sigma-Aldrich--
NCR细胞冷冻保存液Cyagen--
Hoechst染料Invitrogen--
DMEM培养基Gibco Life Technologies--
胎牛血清Gibco Life Technologies--
青霉素/链霉素Gibco Life Technologies--
磷酸盐缓冲液Gibco Life Technologies--
细胞膜红色荧光染色试剂盒(DiI)Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd.AC11038
RIPA裂解缓冲液APExBIOK1120
BCA蛋白浓度测定试剂盒KeyGEN Biotech--
Calcein/PI细胞活力/细胞毒性检测试剂盒Beyotime Biotechnology--
考马斯亮蓝Beyotime Biotechnology--
重组鼠MIP-2/CXCL2Beyotime Biotechnology--
中性粒细胞分离试剂盒Beijing Solarbio Science and Technology Co., Ltd.P9040
细胞增殖检测试剂盒(CCK-8)Beijing Solarbio Science and Technology Co., Ltd.--
二甲基亚砜Beijing Solarbio Science and Technology Co., Ltd.--
兔抗人IL-1R2抗体Abcam--
兔抗人TNFR1抗体Abcam--
兔抗人CXCR2抗体Abcam--
兔抗人TLR4抗体Abcam--
兔抗人IL-6Rα抗体Proteintech--
抗兔IgG二抗Proteintech--
山羊抗兔IgG-Fc二抗(HRP)Beijing Sino Biological Inc.SSA003
山羊抗兔IgG(H+L)Elabscience Biotechnology Co., Ltd.E-AB-1010
小鼠和人TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA试剂盒Dakewe Biotech Co., Ltd.--
Pierce显色内毒素定量试剂盒Thermo Fisher Scientific--
扫描电子显微镜OlympusFV1200
荧光显微镜OlympusIX73
共聚焦激光扫描显微镜NikonA1+
Mini-PROTEAN Tetra电泳系统Bio-Rad--
蛋白质印迹成像系统AmershamImageQuant 800
酶标仪Bio-RadiMark
AniView600多模态活体动物成像系统Biolight--
蛋白上样缓冲液Coolaber--
预制胶GenScript--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
CS-Neus制备
中性粒细胞来源(人外周血或小鼠血液/脾脏)、细胞密度、液氮处理时间
阅读提示:Methods 4.6
脓毒症模型
LPS剂量(30 mg/kg)、给药途径(腹腔注射)、小鼠品系(ICR)、性别(雌性)、周龄(8周)
阅读提示:Methods 4.12
治疗实验
治疗时间点(2, 4, 6小时)、细胞剂量(9.0 × 10^6 counts)、给药方式(静脉注射)、对照组(未治疗、活Neus)
阅读提示:Methods 4.14
体外中和实验
细胞因子初始浓度(TNF-α 600 pg/mL、IL-6 100 pg/mL、IL-1β 400 pg/mL)、CS-Neus浓度梯度、孵育时间(6小时)、温度(37°C)
阅读提示:Methods 4.11
临床样本实验
脓毒症患者血浆来源、CS-Neus浓度(1.0 × 10^7 count/mL)、孵育时间(30分钟)、温度(37°C)
阅读提示:Methods 4.11