细胞毒性评估
测定PTER-ITC对骨肉瘤细胞的毒性作用
使用MTT法检测PTER和PTER-ITC对hFOB 1.19和MG-63细胞活力的影响，并计算IC50。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
紫檀茋-异硫氰酸酯通过破坏β-catenin/TCF-4相互作用抑制人MG-63骨肉瘤细胞增殖——机制见解
Pterostilbene-Isothiocyanate Inhibits Proliferation of Human MG-63 Osteosarcoma Cells via Abrogating β-Catenin/TCF-4 Interaction-A Mechanistic Insight.
实验完整度
中研究包含体外细胞实验（增殖、迁移、凋亡）和机制验证（Co-IP、荧光素酶报告基因），及计算机模拟，但缺乏动物模型或患者样本等体内证据。
主要模型
人骨肉瘤细胞系MG-63 人正常成骨细胞系hFOB 1.19
重点核对
PTER-ITC处理浓度（5、10 μM）对MG-63细胞增殖、迁移和凋亡的影响 β-catenin与TCF-4的物理相互作用（Co-IP实验） β-catenin介导的TCF-4转录激活（TOPFlash荧光素酶报告基因实验） E-cadherin和N-cadherin蛋白表达水平（免疫荧光和免疫印迹）
摘要
骨肉瘤是一种高度转移的骨肿瘤，是全球儿童和青少年死亡和残疾的主要原因。骨肉瘤对手术、放疗和化疗的反应仅次优，且伴有不良副作用。因此，需要更安全的替代治疗方法。本研究通过细胞毒性、伤口愈合和Transwell迁移实验，评估了半合成化合物紫檀茋-异硫氰酸酯（PTER-ITC）对人骨肉瘤MG-63细胞的抗癌作用。结果表明，PTER-ITC特异性抑制骨肉瘤细胞的存活、增殖和迁移。PTER-ITC通过破坏线粒体膜电位诱导MG-63细胞凋亡，这从不同细胞学染色的结果中可见。PTER-ITC的抗转移潜能通过免疫染色、RT-qPCR和免疫印迹评估。计算机模拟（分子对接和动态模拟）以及随后的生化[免疫共沉淀（Co-IP）和荧光素酶报告基因]实验揭示了该化合物的潜在作用模式。PTER-ITC增加了E-钙粘蛋白并降低了N-钙粘蛋白水平，从而促进了上皮-间质转化（EMT）的逆转。它还调节了增殖细胞核抗原（PCNA）、caspase-3、聚[ADP-核糖]聚合酶（PARP-1）和基质金属蛋白酶-2/9（MMPs-2/9）在转录和翻译水平的表达。PTER-ITC在计算机模拟中通过占据TCF-4上的β-catenin结合位点干扰β-catenin/转录因子-4（TCF-4）相互作用，并通过其物理相互作用的减少（Co-IP实验）得到证实。这抑制了β-catenin对TCF-4的转录激活（如荧光素酶报告基因实验所示）。总之，PTER-ITC通过破坏β-catenin/TCF-4相互作用，在体外对人骨肉瘤细胞表现出有效的抗癌作用。总而言之，这项研究表明PTER-ITC可能被视为骨肉瘤治疗的新方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PTER-ITC是否通过靶向Wnt/β-catenin信号通路抑制人骨肉瘤MG-63细胞的增殖和转移？
- 核心机制
- PTER-ITC通过与TCF-4的β-catenin结合位点结合，破坏β-catenin/TCF-4相互作用，从而抑制β-catenin介导的TCF-4转录活性，下调下游靶基因（如PCNA、MMP-2/9）的表达，并逆转EMT。
- 主要证据
- 体外实验：MTT、伤口愈合、Transwell迁移、AO/EtBr和DAPI染色、TUNEL、Rhodamine 123、RT-qPCR、免疫印迹、Co-IP和TOPFlash荧光素酶报告基因实验，以及分子对接和MD模拟。
- 研究意义
- 该研究表明PTER-ITC可能成为一种新的骨肉瘤治疗候选药物，其选择性靶向癌细胞而不影响正常细胞，但需要进一步的体内模型验证。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞增殖和迁移测定
评估PTER-ITC对细胞增殖和迁移的影响
通过伤口愈合实验和Transwell迁移实验，检测PTER-ITC处理后MG-63细胞的增殖和迁移能力。
凋亡诱导检测
验证PTER-ITC是否诱导细胞凋亡
使用AO/EtBr和DAPI染色观察细胞形态变化，TUNEL实验检测DNA断裂，Rhodamine 123染色评估线粒体膜电位。
分子表达分析
检测PTER-ITC对相关标志物表达的影响
通过RT-qPCR和免疫印迹检测增殖、凋亡、转移相关基因的mRNA和蛋白水平。
计算机模拟预测
预测PTER-ITC与TCF-4的结合模式
利用分子对接和MD模拟分析PTER-ITC与TCF-4的结合稳定性和相互作用。
机制验证
验证PTER-ITC对β-catenin/TCF-4相互作用的抑制
通过Co-IP实验检测β-catenin和TCF-4的相互作用，使用TOPFlash荧光素酶报告基因检测TCF-4转录活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞活力
验证细胞增殖和迁移
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM-F12培养基 | Himedia | AT106 |
| α-MEM培养基 | Himedia | AT154 | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | -- | |
| 细胞毒性检测 | MTT | Himedia | TC191 |
| 免疫染色封闭 | 牛血清白蛋白 | Himedia | TC194 |
| 细胞凋亡检测 | 吖啶橙 | Himedia | MB116 |
| 溴化乙锭 | Himedia | MB071 | |
| DAPI | Himedia | MB097 | |
| 线粒体膜电位检测 | 罗丹明123 | Cayman Chemicals | 16672 |
| 细胞凋亡检测 | TUNEL检测试剂盒 | AAT Bioquest | 22853 |
| 免疫印迹 | 抗PCNA抗体 | Elabscience | E-AB-10010 |
| 抗切割PARP-1抗体 | Elabscience | E-AB-30059 | |
| 抗MMP-2抗体 | Elabscience | E-AB-32054 | |
| 抗MMP-9抗体 | Elabscience | E-AB-70247 | |
| 抗活性Caspase-3抗体 | Elabscience | E-AB-22115 | |
| 抗TCF-4抗体 | Elabscience | E-AB-60206 | |
| 抗β-actin抗体 | Elabscience | E-AB-20058 | |
| 抗E-cadherin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-8426 | |
| 抗N-cadherin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-8424 | |
| 抗β-catenin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-7963 | |
| HRP标记抗小鼠二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 115-035-003/111 | |
| HRP标记抗兔二抗 | Jackson ImmunoResearch Laboratory | 111-035-003/111 | |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠FITC二抗 | Thermo Fisher Scientific | 62-6511 |
| 山羊抗小鼠TRITC二抗 | Thermo Fisher Scientific | A16071 | |
| RT-qPCR | 逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | EP0441 |
| SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | K0221 | |
| 免疫共沉淀 | Protein A琼脂糖珠 | G Biosciences | 786-283 |
| 转染 | Polyfect转染试剂 | Qiagen Inc. | 301105 |
| RT-qPCR | 引物 | Eurofins Scientific | -- |
| 试剂配制 | 二甲基亚砜 | Sisco Research Laboratories | -- |
| 甲醇 | Sisco Research Laboratories | -- | |
| 氯仿 | Sisco Research Laboratories | -- | |
| 化合物合成 | 紫檀茋-异硫氰酸酯 | -- | -- |
| Transwell迁移实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 细胞迁移染色 | 结晶紫 | Himedia | -- |
| 划痕实验 | ImageJ软件 | -- | -- |
| 显微成像 | Zeiss Axiovert 25显微镜 | Zeiss | -- |
| 荧光成像 | BioTek Lionheart LX自动显微镜 | BioTek | -- |
| 吸收光检测 | Fluostar optima酶标仪 | BMG Labtech | -- |
| RT-qPCR | Quant Studio 3实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- |
| 免疫印迹 | PVDF膜 | Advanced Microdevices Pvt. Ltd. | SVFX8301XXXX101 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 鲁米诺试剂 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| TOPFlash荧光素酶报告基因实验 | M50 Super 8x TOPFlash质粒 | Addgene | 12456 |
| β-半乳糖苷酶质粒 | -- | -- | |
| 分子对接 | AutoDock Tools | -- | -- |
| ACD/ChemSketch | -- | -- | |
| Avogadro | -- | -- | |
| Pyrx | -- | -- | |
| PyMOL | -- | -- | |
| Maestro | Schrödinger | -- | |
| 分子动力学模拟 | GROMACS | -- | -- |
| PRODRG | -- | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | hFOB 1.19细胞培养于含G418 (0.3 mg/mL)、2.5 mM L-谷氨酰胺和10% FBS的DMEM-F12培养基，34°C；MG-63细胞培养于含10% FBS和1%抗生素的α-MEM培养基，37°C，5% CO2。 阅读提示：Methods 2.2 Cell Culture |
| 细胞毒性检测 | PTER-ITC浓度（2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 100 μM），处理24小时，MTT浓度5 mg/mL，孵育4小时，检测波长570 nm。 阅读提示：Methods 2.3 Cytotoxicity Assay 和 Figure 1 |
| 细胞增殖和迁移 | 划痕实验：PTER-ITC浓度5和10 μM，ZA 10 μM，观察12和24小时；Transwell迁移：1.25 × 10^5细胞/孔，处理24小时，结晶紫染色。 阅读提示：Methods 2.4 Wound-Healing Assay 和 2.6 In Vitro Cell Migration Assay |
| 凋亡检测 | PTER-ITC浓度5和10 μM，处理24小时；TUNEL染色使用TdT染色溶液（45 μL TdT反应缓冲液、5 μL CoCl2、0.5 μL TF5-dUTP、0.5 μL TdT酶），孵育2小时；Rhodamine 123浓度10 μg/mL，孵育20-25分钟。 阅读提示：Methods 2.7 Mitochondrial Membrane Potential Integrity Assay 和 2.8 TUNEL Assay |
| 分子表达分析 | RT-qPCR使用SYBR Green Master Mix，β-actin作为内参，ΔΔCt法；免疫印迹使用RIPA缓冲液裂解，PVDF膜，一抗稀释1:1000，二抗1:5000，ECL显色。 阅读提示：Methods 2.10 RT-qPCR Analysis 和 2.11 Protein Expression and Immunoblot Analysis |
| 机制验证 | Co-IP：使用β-catenin或TCF-4抗体（1:100）免疫沉淀，Protein A-Sepharose beads；TOPFlash：MG-63细胞共转染450 ng/well TOPFlash质粒和0.6 ng/well β-gal质粒，处理不同浓度PTER-ITC 24小时，检测荧光素酶活性。 阅读提示：Methods 2.13 Co-Immunoprecipitation Assay 和 2.14 TOPFlash Luciferase Assay |