病毒扩增与滴度测定
制备用于动物感染的SARS-CoV-2病毒储备液，并确定其感染滴度。
在Vero E6细胞中扩增SARS-CoV-2（祖先型武汉株），通过空斑实验测定PFU/ml和TCID50/ml。
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叙利亚金仓鼠感染SARS-CoV-2后的基因组突变及相关肺部病理
Genomic Mutations in SARS-CoV-2 Genome following Infection in Syrian Golden Hamster and Associated Lung Pathologies.
实验完整度
高研究包含动物感染模型、病毒载量检测、中和抗体检测、组织病理学、NGS测序等多层级实验验证。
主要模型
叙利亚金仓鼠（雄性） 叙利亚金仓鼠（雌性） Vero-E6细胞
重点核对
病毒株：SARS-CoV-2 USA-WA1/2020（祖先型武汉株，NR-52281） 感染剂量：105 TCID50/只，经鼻内接种100 μL 时间点：0、2、3、4、5、7、14 dpi 样本量：每组5只（n=5），另有未感染对照组
摘要
SARS-CoV-2病毒的持续进化促使人们不断努力理解SARS-CoV-2变异株对人类健康的影响。本研究旨在确定感染祖先型武汉株SARS-CoV-2的雄性和雌性仓鼠中遗传突变的累积及相关的肺部病理。本研究表明，雄性和雌性仓鼠之间的病毒载量无显著差异，两性动物的感染峰值均出现在感染后第4天。通过TCID-50检测，活病毒颗粒可被检测至感染后5天，而qRT-PCR可在所有感染动物的14天感染期（dpi）内检测到病毒RNA。此外，中和抗体滴度的测定显示，两性在感染后第4天即出现针对SARS-CoV-2的体液免疫反应，并观察到针对SARS-CoV-2 delta变异株的显著交叉保护作用。组织病理学显示，两性在3至14 dpi期间出现水肿、炎症、炎性细胞浸润、坏死以及肺泡和支气管上皮细胞的变性。此外，下一代测序（NGS）显示，从雄性和雌性仓鼠中分离的SARS-CoV-2（祖先型武汉株）基因组中最多有10个单核苷酸多态性（SNP）。在从两性仓鼠中分离的SARS-CoV-2基因组中观察到的23014位点突变（Glu484Asp）在小分子药物、疫苗和靶向S蛋白的单克隆抗体的抗病毒效力中发挥重要作用。本研究表明，在仓鼠中评估抗SARS-CoV-2抗病毒药物的临床前效力时，任一性别的动物均可使用。然而，考虑到S蛋白中的主要突变，了解SARS-CoV-2通过仓鼠后的基因突变对于确定靶向S蛋白的抗病毒药物的效力至关重要。重要性：我们的研究结果表明，SARS-CoV-2在通过叙利亚金仓鼠后积累了基因组突变。了解基因组突变表明，雄性或雌性仓鼠均可用于抗病毒药物和疫苗的临床前功效评估。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在确定SARS-CoV-2（祖先型武汉株）在雄性和雌性叙利亚金仓鼠中的复制能力、感染进程、肺部病理以及基因组突变的累积情况，并探究性别差异是否对感染结果产生影响。
- 核心机制
- SARS-CoV-2感染仓鼠后，其基因组出现多个SNP，其中S蛋白的Glu484Asp突变位于受体结合域，可能影响小分子药物、疫苗和单克隆抗体的抗病毒效果。
- 主要证据
- NGS测序显示雄性和雌性仓鼠均存在10个SNP；TCID-50和qRT-PCR显示感染峰值在4 dpi；组织病理学显示肺部病变从2 dpi开始，4-7 dpi加重。
- 研究意义
- 研究结果支持在仓鼠模型中利用任一性别进行抗病毒药物和疫苗的临床前功效评估，并强调评估靶向S蛋白抗病毒药物时需考虑病毒突变。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
仓鼠感染模型建立
建立雄性和雌性叙利亚金仓鼠的SARS-CoV-2感染模型，用于研究病毒复制、病理和免疫反应。
将雄性（n=5）和雌性（n=5）仓鼠经鼻内感染105 TCID50的SARS-CoV-2，在2、3、4、5、7、14 dpi处死动物并收集样本。
病毒载量检测
定量检测感染后不同时间点肺组织中的传染性病毒和病毒RNA。
取肺组织匀浆，用TCID-50法检测传染性病毒滴度，并用qRT-PCR检测病毒RNA拷贝数。
中和抗体检测
评估感染仓鼠产生的特异性中和抗体及对不同SARS-CoV-2变异株的交叉反应。
采集血清，采用微量中和试验（MNT）检测对祖先型Wuhan和delta变异株的中和抗体滴度。
肺部组织病理学评估
观察SARS-CoV-2感染引起的肺部病理变化及其随时间的变化。
收集肺组织，固定，石蜡包埋，切片（3 μm），HE染色，显微镜下评估炎症、坏死、水肿等。
病毒基因组NGS测序
鉴定SARS-CoV-2在仓鼠体内传代后产生的基因组突变。
提取病毒stock和感染仓鼠肺组织的RNA，进行全基因组测序，比对分析SNP。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素-两性霉素B溶液 | -- | -- | |
| 病毒扩增 | Vero-E6细胞系（C1008） | Elabscience Biotechnology Inc. | EP-CL-0491 |
| SARS-CoV-2, USA-WA1/2020 | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2, B.1.617.2（delta） | BEI Resources | NR-55611 | |
| 组织匀浆 | 组织匀浆机 | BIOSPEC PRODUCTS INC., USA | 985370EUR-07 |
| RNA提取 | QIAamp病毒RNA小提试剂盒 | Qiagen | -- |
| qRT-PCR | US-2019-nCoV检测试剂 | Sigma Darmstadt, Germany | CDA00011 |
| NGS测序 | NextSeq500测序平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物感染模型 | 动物品系（叙利亚金仓鼠）、性别、每组数量（n=5）、麻醉剂量（氯胺酮150 mg/kg，甲苯噻嗪10 mg/kg）、感染途径（鼻内）、病毒剂量（105 TCID50/只）、感染体积（100 μL） 阅读提示：见2.2节 SARS-CoV-2 Infection in Syrian Golden Hamsters |
| 病毒载量检测 | 组织匀浆比例（1:2 w/v）、匀浆时间（10秒）、检测方法（TCID-50和qRT-PCR）、引物/探针（US-2019-nCoV Assays） 阅读提示：见2.3节 Determination of Viral Load from the Lung Samples |
| 中和抗体检测 | 血清灭活条件（56°C，1小时）、病毒量（100 TCID50）、检测方法（MNT） 阅读提示：见2.5节 Immune Response against SARS-CoV-2 Infection in Hamsters |
| 组织病理学 | 肺叶（左叶）、固定（10%缓冲福尔马林）、切片厚度（3 μm）、染色（HE）、放大倍数（10×和60×） 阅读提示：见2.6节 Lung Histopathology |
| NGS测序 | 样本（病毒stock、雄性和雌性仓鼠各1只，4 dpi）、测序平台（NextSeq500）、SNP分析工具（mpileup, Samtools版本0.1.18） 阅读提示：见2.4节 Next-Generation Sequencing (NGS) to Study Mutation in the Viral RNA |