FSP1蛋白的表达、纯化与结晶
获得FSP1蛋白的晶体结构，揭示其催化机制的结构基础。
将全长或截短的cFSP1和hFSP1基因克隆至pET载体重组表达于大肠杆菌BL21(DE3)，经Ni亲和层析和凝胶过滤纯化。cFSP1ΔN进行还原性甲基化处理，并与CoQ1共结晶。采用Se-Met衍生和SAD法或分子置换解析结构。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
FSP1催化与铁死亡抑制的结构学见解
Structural insights into FSP1 catalysis and ferroptosis inhibition.
实验完整度
高包含晶体结构解析、体外酶活测定、细胞铁死亡功能验证及HPLC-MS等分析，多个独立证据层级支持结论。
主要模型
鸡FSP1（cFSP1）重组蛋白 人FSP1（hFSP1）重组蛋白 HT1080细胞及hFSP1敲除细胞系 HEK293T细胞
重点核对
cFSP1（12-373残基）与CoQ1共晶结构（分辨率2.6 Å） CTD缺失突变体（cFSP1ΔCTD、hFSP1ΔCTD）的NADH氧化活性丧失 hFSP1 E156A和L330S突变对CoQ氧化还原酶活性及铁死亡抑制的影响 HPLC-MS/MS鉴定重组FSP1中6-羟基-FAD的存在 6-羟基-FAD对HT1080 hFSP1KO细胞RSL3诱导铁死亡的挽救作用
摘要
铁死亡抑制蛋白1（FSP1，也称为AIMF2、AMID或PRG3）是一种最近发现的谷胱甘肽非依赖性铁死亡抑制因子1-3，但其潜在的结构机制仍然未知。在此，我们报告了鸡（Gallus gallus）FSP1在其无底物和泛醌结合形式的晶体结构。这些结构揭示了一个FAD结合结构域和一个NAD(P)H结合结构域，两者均与AIF和NADH氧化还原酶共有4-9，以及一个特征性的羧基末端结构域。我们证明了羧基末端结构域通过介导FSP1的功能性二聚化以及对位于FAD两侧的两个活性位点的形成至关重要，这两个活性位点分别负责泛醌还原和独特的FAD羟基化。我们还确定FSP1在体外存在氧和NAD(P)H的情况下能够催化H2O2的产生以及FAD向6-羟基-FAD的转化，并且6-羟基-FAD在细胞中直接抑制铁死亡。总之，这些发现加深了我们对FSP1催化和铁死亡抑制机制的理解，并确立了6-羟基-FAD作为FSP1中的活性辅因子和铁死亡抑制中的强效自由基捕获抗氧化剂。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FSP1如何通过其氧化还原酶活性催化泛醌还原并抑制铁死亡，其结构基础是什么？
- 核心机制
- FSP1通过其C末端结构域介导功能性同源二聚化，形成两个活性位点：泛醌还原口袋和FAD羟基化口袋。在NAD(P)H存在下，FSP1结合的FAD被还原为FADH2，然后将电子传递给CoQ生成泛醇，或传递给氧气生成H2O2；H2O2可进一步介导FAD羟基化为6-羟基-FAD，后者作为活性辅因子和自由基捕获抗氧化剂抑制铁死亡。
- 主要证据
- 晶体结构显示CTD介导二聚化并形成两个活性位点；酶活实验表明CTD缺失或关键残基突变（如E155A/E156A、L329S/L330S）降低或消除NADH氧化活性；细胞实验显示hFSP1ΔCTD、E156A突变丧失铁死亡抑制功能，而L330S部分保留；6-羟基-FAD可直接挽救HT1080 hFSP1KO细胞的铁死亡敏感性。
- 研究意义
- 本研究阐明了FSP1催化活性与铁死亡抑制的结构机制，为基于FSP1-CoQ10系统的药物设计和筛选提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FSP1同源二聚化及CTD功能验证
验证FSP1形成同源二聚体，并检测CTD在二聚化、酶活及铁死亡抑制中的作用。
通过凝胶过滤色谱和动态光散射分析FSP1在溶液中的寡聚状态，通过免疫共沉淀验证细胞内的自相互作用。构建CTD截短突变体，测定NADH氧化活性，并在HT1080 hFSP1KO细胞中检测突变体对RSL3诱导铁死亡的抑制作用。
FAD和CoQ1结合口袋的结构分析
确定FAD和泛醌在FSP1中的结合位点，并阐明与催化功能相关的关键残基。
解析cFSP1ΔN与CoQ1的复合物结构，分析FAD和CoQ1的结合模式，鉴定参与结合的残基。通过点突变（如K117A、K292A/M293A/Y295A、R53A）验证这些残基对NADH氧化活性的影响。
FSP1氧化还原酶及底物特异性分析
测定FSP1对NADH和NADPH的利用效率，并验证其CoQ还原活性。
通过酶动力学实验测定FSP1氧化NADH和NADPH的Km和kcat值，比较CoQ1存在时的活性。
6-羟基-FAD的鉴定与功能研究
确认FSP1产生6-羟基-FAD，并研究其在铁死亡抑制中的直接作用。
通过HPLC-MS/MS和NMR鉴定重组FSP1中的6-羟基-FAD。制备FAD或6-羟基-FAD重构的hFSP1，比较其NADH氧化活性。在HT1080野生型及hFSP1KO细胞中，用6-羟基-FAD处理，评估对RSL3诱导铁死亡的挽救效果。并使用FENIX测定其自由基捕获活性。
H2O2产生及FAD羟基化反应验证
验证FSP1在NAD(P)H和氧存在下产生H2O2，并研究FAD羟基化活性。
使用荧光探针试剂盒检测酶反应中H2O2的产生。将FAD重构的cFSP1或hFSP1与NADPH和H2O2孵育，用HPLC分析FAD向6-羟基-FAD的转化。使用E155A/E156A突变体验证关键残基的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | pET-22b载体 | Novagen | -- |
| pET28a-His-SUMO载体 | -- | -- | |
| QuikChange定点突变试剂盒 | Agilent | -- | |
| BL21 (DE3)感受态细胞 | -- | -- | |
| LB培养基 | -- | -- | |
| 蛋白纯化 | Ni螯合琼脂糖快流速树脂 | GE Healthcare | -- |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| HiTrap Heparin HP柱 | GE Healthcare | -- | |
| 超高压细胞破碎仪 | JNBIO | -- | |
| 蛋白结晶 | PEG550MME | -- | -- |
| 辅酶Q1 | -- | -- | |
| 结构解析 | XDS数据处理软件 | -- | -- |
| HKL3000数据处理软件 | -- | -- | |
| PHENIX软件 | -- | -- | |
| COOT软件 | -- | -- | |
| PyMOL软件 | -- | -- | |
| ChimeraX软件 | -- | -- | |
| 酶活测定 | AMR-100酶标仪 | Allsheng | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | -- | |
| TRIzol试剂 | Ambion | -- | |
| HiScript II Q RT SuperMix逆转录试剂盒 | Vazyme | -- | |
| pcDNA3.1载体 | Invitrogen | -- | |
| LentiCRISPRv2载体 | Addgene | 52961 | |
| 蛋白检测 | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Bradford蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Millipore | -- | |
| 抗FSP1抗体 | Proteintech | 20886-1-AP | |
| 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| 抗HSP90抗体 | ZSGB-BIO | TA-12 | |
| 抗β-actin抗体 | ZSGB-BIO | TA-09 | |
| 辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| 免疫共沉淀 | 抗FLAG M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 抗FLAG抗体 | Invitrogen | PA1-984B | |
| 抗Myc抗体 | CST | 2278 | |
| 细胞死亡检测 | Sytox Green染料 | Thermo Fisher | -- |
| RSL3 | -- | -- | |
| Ferrostatin-1 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo Laboratories | -- |
| FENIX assay | 蛋黄卵磷脂脂质体 | -- | -- |
| STY-BODIPY荧光探针 | -- | -- | |
| 四氢生物蝶呤 | -- | -- | |
| Mithras LB940酶标仪 | Berthold Technologies | -- | |
| 凝胶过滤 | 凝胶过滤分子量标准品 | Sigma-Aldrich | MWGF1000-1KT |
| DLS | DynaPro NanoStar动态光散射仪 | Wyatt Technology | -- |
| Dynamics 7.0软件 | Wyatt Technology | -- | |
| 6-羟基-FAD制备 | HiTrap Q HP阴离子交换柱 | GE Healthcare | -- |
| Supelclean LC-18固相萃取柱 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 真空冷冻干燥机 | Heto-Holten | -- | |
| Bruker Avance DRX-600核磁共振波谱仪 | Bruker Corp. | -- | |
| HPLC | Shimadzu LC-10AT VP高效液相色谱泵 | Shimadzu | -- |
| YMC-pack pro-C18反相色谱柱 | YMC | -- | |
| HPLC-MS/MS | 超高效液相色谱系统 | Dionex | -- |
| 电喷雾-四极杆-飞行时间质谱仪 | Bruker Daltonics | -- | |
| FAD标准品 | Sigma-Aldrich | F6625 | |
| micro-FTIR | Nicolet iN10 MX傅里叶变换红外光谱仪 | Thermo-Fisher | -- |
| 辅因子重构 | 尿素 | -- | -- |
| H2O2检测 | 过氧化氢荧光检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| Enspire多功能酶标仪 | PerkinElmer | -- | |
| 统计绘图 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白表达与纯化 | 表达菌株（BL21(DE3)）、诱导条件（0.1 mM IPTG，18°C，16h）、纯化缓冲液（buffer A：PBS pH7.4, 150 mM KCl, 5% glycerol, 5 mM β-mercaptoethanol） 阅读提示：Methods: The cloning, expression, and purification of FSP1 |
| 结晶与结构解析 | cFSP1ΔN浓度（~3 mg/ml）、结晶条件（1.8 M (NH4)2SO4, 0.1 M Bis-Tris pH6.5, 3% PEG550MME；CoQ1: 14% PEG8000, 0.1 M MES pH6.2, 160 mM CaAc2, 20% glycerol）、CoQ1浓度（300 μM共结晶） 阅读提示：Methods: Crystallization, data collection, and structure determination |
| 酶活测定 | 反应缓冲液（50 mM Tris-HCl pH8.0, 250 mM NaCl）、底物浓度（NAD(P)H 500 μM, CoQ1 200 μM）、酶浓度（cFSP1 0.5 μM, hFSP1 0.2 μM）、340 nm吸收变化 阅读提示：Methods: NAD(P)H oxidation and enzyme kinetics assays |
| 细胞铁死亡实验 | HT1080 hFSP1KO细胞株、转染试剂（Lipofectamine 3000）、RSL3浓度（75 nM）、处理时间（3h）、Fer-1浓度（2 μM）、细胞密度（24孔板100000/孔） 阅读提示：Methods: Human cell death and viability assays 及图2,4图注 |
| 6-羟基-FAD制备与检测 | 6-羟基-FAD纯化方法（镍柱、Q柱、SPE）、HPLC-MS条件（YMC C18柱，流动相A: 5 mM 乙酸铵 pH5.0, B: 100% 乙腈，梯度5%-50% B，波长254 nm） 阅读提示：Methods: Preparation of 6-hydroxy-FAD, HPLC and HPLC-MS/MS |