刺苋提取物制备与植物化学分析
鉴定刺苋甲醇叶提取物中的主要植物化学物质，并评估其抗氧化和抗炎潜力。
使用索氏提取器以甲醇为溶剂制备提取物；通过植物化学定性分析、TLC和GC-MS鉴定化合物；DPPH实验评估自由基清除活性；hRBC膜稳定实验评估抗炎活性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
富含谷甾醇的刺苋（Digera muricata）通过调节巨噬细胞中NF-κB/iNOS信号通路对抗7-酮胆固醇和脂多糖介导的致动脉粥样硬化反应
Sitosterol-rich Digera muricata against 7-ketocholesterol and lipopolysaccharide-mediated atherogenic responses by modulating NF-ΚB/iNOS signalling pathway in macrophages.
实验完整度
中研究涉及提取物制备、体外细胞模型、功能检测（NO、ROS、脂质积累等）及基因/蛋白表达分析，但缺乏动物模型和患者样本等体内验证。
主要模型
IC-21巨噬细胞系（M2表型） 7-酮胆固醇（7KCh）和脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞动脉粥样硬化模型
重点核对
IC-21巨噬细胞培养条件：RPMI-1640培养基，10% FBS，37°C，5% CO2 7KCh处理浓度：8 µg/ml，LPS处理浓度：200 ng/ml，共处理24小时 刺苋甲醇叶提取物处理浓度：25-400 µg/ml（有效浓度400 µg/ml） NO测定采用Griess试剂，ROS测定采用DCFH-DA染色 基因表达分析采用RT-PCR，蛋白表达采用免疫细胞化学
摘要
刺苋（Digera muricata L.），俗称Tartara，是一种可食用草本植物，在非洲和亚洲许多国家被用作传统药物。本研究旨在阐明富含植物甾醇的刺苋提取物对7-酮胆固醇介导的巨噬细胞动脉粥样硬化的影响。通过植物化学分析、GC-MS、TLC、DPPH清除和hRBC膜稳定试验对提取物进行了检测。基于alamar blue细胞活力和Griess试验确定实验分组，研究巨噬细胞极化。测定了精氨酸酶活性、ROS生成、线粒体膜电位、细胞膜完整性、胞饮作用、脂质摄取和过氧化以及细胞内钙沉积的调节。此外，使用PCR、ELISA和免疫细胞化学技术分析了致动脉粥样硬化介质的表达。在刺苋中检测到多种植物化学物质，具有较高的自由基清除活性和抗炎潜力。与刺苋共处理显著降低了7KCh在LPS存在下诱导的致动脉粥样硬化反应，如ROS，尤其是NO和O2−以及脂质过氧化。此外，刺苋显著正常化了线粒体膜电位、细胞膜完整性、胞饮活性、细胞内脂质积累和钙沉积。这些结果为我们提供了刺苋改善动脉粥样硬化形成的潜力。此外，它降低了促动脉粥样硬化介质（iNOS、COX-2、MMP9、IL-6、IL-1β、CD36、CD163和TGFβ1）的表达，并增加了抗动脉粥样硬化介质（MRC1和PPARγ），同时NF-κB和iNOS的细胞表达较高。结果表明，富含谷甾醇的刺苋作为对抗异常巨噬细胞极化及其相关病理的多功能生物医学治疗剂具有潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 富含植物甾醇的刺苋（Digera muricata）甲醇叶提取物是否能通过调节巨噬细胞极化，抑制7-酮胆固醇和脂多糖诱导的巨噬细胞致动脉粥样硬化反应，并探讨其潜在机制。
- 核心机制
- 刺苋提取物通过下调NF-κB/iNOS信号通路，减少促炎介质（如iNOS、COX-2、MMP9、IL-6、IL-1β）和清道夫受体（CD36、CD163）的表达，同时上调抗炎介质（如MRC1、PPARγ），从而抑制巨噬细胞向M1表型极化，促进M2表型，减轻氧化应激和脂质积累。
- 主要证据
- 在IC-21巨噬细胞中，7KCh和LPS共处理诱导ROS、NO、O2−、脂质过氧化、脂质积累和钙沉积增加，并降低精氨酸酶活性；刺苋提取物共处理逆转了这些效应，降低促炎基因表达，增加抗炎基因表达，并下调NF-κB和iNOS蛋白表达。
- 研究意义
- 研究表明刺苋提取物可能作为多功能生物医学治疗剂，用于预防异常巨噬细胞极化及其相关病理，特别是动脉粥样硬化，支持其作为传统药物的潜在应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞活力与细胞形态评估
确定7KCh、LPS和刺苋提取物对IC-21巨噬细胞活力的剂量影响，并选择实验用浓度。
使用alamar blue实验测定细胞活力，并通过相差显微镜观察细胞形态。
验证炎症介质与氧化应激
评估7KCh和LPS诱导的巨噬细胞中NO、ROS、O2−和脂质过氧化水平，并测试刺苋提取物的调节作用。
使用Griess实验测定NO，DCFH-DA染色评估ROS，NBT实验检测O2−，TBA实验测定脂质过氧化。
功能与代谢指标评估
评估7KCh和LPS对巨噬细胞功能（胞饮作用、脂质积累、线粒体膜电位、细胞膜完整性和钙沉积）的影响，以及刺苋提取物的保护作用。
通过中性红摄取实验测定胞饮活性，油红O染色评估脂质积累，Rh123/DAPI染色分析线粒体膜电位，AO/EB染色检测细胞膜完整性，茜素红S染色评估钙沉积。
基因与蛋白表达分析
分析7KCh和LPS诱导的巨噬细胞中促动脉粥样硬化和抗动脉粥样硬化介质的基因和蛋白表达，并评估刺苋提取物的调节作用。
使用RT-PCR检测iNOS、COX-2、MMP9、IL-1β、IL-6、CD36、CD163、MRC1、PPARγ的mRNA表达；ELISA检测TGFβ1分泌；免疫细胞化学检测NF-κB和iNOS蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 提取 | 索氏提取器 | -- | -- |
| 薄层色谱分析 | 硅胶60 F254薄层色谱板 | Merck | -- |
| 气相色谱-质谱分析 | 安捷伦GC 7890A/MS5975C气相色谱-质谱联用仪 | Agilent | -- |
| 安捷伦DB5MS毛细管柱 | Agilent | -- | |
| 抗氧化活性测定 | 2,2-二苯基-1-苦基肼 | -- | -- |
| 抗炎活性测定 | 地塞米松 | -- | -- |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞活力测定 | alamar blue | -- | -- |
| NO检测 | Griess试剂 | -- | -- |
| 胞饮活性测定 | 中性红 | -- | -- |
| 脂质积累测定 | 油红O | -- | -- |
| ROS检测 | 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 | -- | -- |
| 超氧阴离子检测 | 氮蓝四唑 | -- | -- |
| 线粒体膜电位检测 | 罗丹明123 | -- | -- |
| 细胞核染色 | 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | -- | -- |
| 细胞膜完整性检测 | 吖啶橙 | -- | -- |
| 溴化乙锭 | -- | -- | |
| 钙沉积检测 | 茜素红S | -- | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| cDNA合成 | Thermo Scientific第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| ELISA | TGFβ1 ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| 显微镜观察 | 卡尔蔡司共聚焦荧光显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| 尼康相差显微镜 | Nikon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | IC-21巨噬细胞系培养条件：RPMI-1640培养基，10% FBS，1%抗生素，37°C，5% CO2 阅读提示：Materials and methods, Culture of IC-21 macrophage cell line |
| 药物处理 | 7KCh浓度：8 µg/ml，LPS浓度：200 ng/ml，刺苋提取物浓度：400 µg/ml，处理时间24小时，培养基含0.5% FBS 阅读提示：Materials and methods, Determination of cell viability, Nitric oxide estimation; Results, Fig. 8, Fig. 9 |
| NO测定 | Griess实验：培养上清50 µl与0.1% NED和1%磺胺各50 µl混合，孵育20分钟，540 nm测量 阅读提示：Materials and methods, Estimation of nitric oxide using Griess reagent |
| ROS测定 | DCFH-DA浓度：0.1%，孵育30分钟，激发485 nm，发射530 nm 阅读提示：Materials and methods, Qualitative and quantitative assessment of ROS generation |
| 基因表达分析 | RT-PCR：RNA提取用TRIzol，cDNA合成用Thermo Scientific试剂盒，引物序列在文中表1，PCR产物琼脂糖凝胶电泳 阅读提示：Materials and methods, Isolation of total RNA, RT-PCR and target sequence amplification; Table 1 |