LIPG表达上调及功能验证
确定LIPG是否在HBV阳性细胞中高表达并影响HBV感染。
通过单细胞转录组分析发现LIPG在HBV阳性HC1细胞中上调；用LIPG shRNA转导HC1和PXB细胞，检测LIPG表达水平以及HBV DNA、cccDNA和pgRNA水平。
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内皮脂肪酶在乙型肝炎病毒感染中的功能参与。
Functional involvement of endothelial lipase in hepatitis B virus infection.
实验完整度
高包含体外细胞系（HC1、HepG2-NTCP-C4、Huh7-NTCP-YFP等）、人源化小鼠肝细胞（PXB细胞）、患者肝组织样本等多种模型，并进行了基因敲低/敲除、过表达、突变体、抑制剂、免疫共沉淀、HiBiT结合实验等机制验证和功能验证。
主要模型
HC1细胞 人源化肝脏嵌合小鼠来源的肝细胞（PXB细胞） HepG2-NTCP-C4细胞 Huh7-NTCP-YFP细胞
重点核对
LIPG表达水平（mRNA和蛋白） shRNA或siRNA介导的LIPG敲低 LIPG抑制剂的浓度和处理时间 肝素和肝素酶处理 HBV吸附和感染时间的设置
摘要
背景：乙型肝炎病毒（HBV）感染引起慢性肝病，并导致肝细胞癌（HCC）的发展。为了鉴定支持HBV生命周期的宿主因子，我们先前建立了维持HBV感染的HC1细胞系，并鉴定了HBV持续存在所需的宿主基因。方法：本研究聚焦于内皮脂肪酶（LIPG），它与细胞膜上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）结合。结果：我们发现，在表达针对LIPG的短发夹RNA（shRNA）的慢病毒转导的人源化肝脏嵌合小鼠来源的肝细胞中，HBV感染受损。LIPG的长期抑制联合恩替卡韦进一步抑制了HBV复制。通过使用2个表达牛磺胆酸钠共转运多肽（NTCP）的细胞系，LIPG被证明参与HBV与细胞表面的附着，并揭示了LIPG与HBV大表面蛋白的直接相互作用。肝素和肝素酶几乎完全抑制了LIPG诱导的HBV附着增加，表明LIPG加速了HBV与HSPGs的附着，随后通过NTCP进入。令人惊讶的是，荧光标记的NTCP结合preS1探针与表达NTCP的细胞的附着并未被肝素损害，表明preS1探针与NTCP的附着不依赖HSPG。有趣的是，在LIPG敲低或敲除细胞中，preS1探针的附着严重受损。LIPG脂肪酶活性抑制剂同样损害了preS1探针与表达NTCP的细胞的附着。结论：LIPG通过上调HBV与细胞膜的附着参与HBV感染，其可能机制有两种：增加HBV与HSPGs的附着，或通过其脂肪酶活性促进HBV与NTCP的HSPG依赖性或非依赖性附着。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 宿主因子内皮脂肪酶（LIPG）是否以及如何参与HBV感染？
- 核心机制
- LIPG通过两种机制促进HBV附着：一是增加HBV与细胞表面HSPGs的结合，二是通过其脂肪酶活性促进HBV（preS1区域）与NTCP的结合，可能独立于HSPGs。
- 主要证据
- 在HC1和PXB细胞中敲低LIPG降低HBV DNA、cccDNA和pgRNA水平；在HepG2-NTCP-C4和Huh7-NTCP-YFP细胞中，LIPG过表达增加而敲低或抑制酶活性降低HBV附着；免疫共沉淀显示LIPG与LHBs直接相互作用；HiBiT实验显示LIPG增加HSPGs与HBV颗粒的结合；preS1探针实验显示LIPG影响preS1与NTCP的结合。
- 研究意义
- LIPG可能成为开发新型抗HBV药物的潜在靶点，长期抑制LIPG联合恩替卡韦治疗可能有效抑制HBV复制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LIPG对HBV附着的影响
验证LIPG是否影响HBV与宿主细胞的附着。
在HepG2-NTCP-C4-LIPG细胞中过表达LIPG，在Huh7-NTCP-YFP细胞中用siRNA敲低LIPG或使用LIPG KO细胞，并采用肝素/肝素酶处理，进行HBV附着实验。
LIPG与HBV大表面蛋白的相互作用
验证LIPG是否与HBV表面蛋白直接结合。
在Huh7细胞中共表达HA标记的LIPG和Flag标记的LHBs（或MHBs/SHBs/preS1肽），进行免疫共沉淀和超分辨显微镜观察共定位。
LIPG促进HSPGs与HBV颗粒结合
验证LIPG是否增加HBV与HSPGs的结合。
使用HiBiT-HBVcc和ELISA板的HSPGs捕获系统，加入重组LIPG蛋白或使用过表达LIPG的细胞裂解液，检测HiBiT活性。
LIPG对preS1探针与NTCP结合的影响
验证LIPG是否影响preS1区域与NTCP的结合。
使用荧光标记的preS1探针（2-48aa）与Huh7-NTCP-YFP细胞或LIPG KO细胞结合，在有无肝素或Myrcludex B条件下检测荧光信号。
LIPG脂肪酶活性对HBV附着的作用
验证LIPG的脂肪酶活性是否参与HBV附着。
使用LIPG抑制剂（GSK-264220A和orlistat）处理Huh7-NTCP-YFP细胞，并进行HBV附着实验；同时过表达野生型LIPG或酶活性缺陷突变体（R330A和N393A），检测HBV附着。
长期LIPG抑制对HBV复制的影响
评估长期抑制LIPG是否减少HBV复制，以及其与恩替卡韦联合的效果。
PXB细胞转导LIPG或对照shRNA，感染HBV后培养4周，部分加入ETV，检测LIPG表达、cccDNA和pgRNA水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PXB细胞（人源化肝脏嵌合小鼠来源的肝细胞） | PhoenixBio | -- | |
| 细胞转染 | FuGENE-HD转染试剂 | Promega | -- |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| CRISPR基因敲除 | LIPG sgRNA（CRISPR677191_SGM） | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Cas9蛋白 | Takara Bio | -- | |
| GenomONE-GE转染试剂 | Ishihara Sangyo | -- | |
| 药物处理 | 肝素 | R&D Systems | -- |
| 肝素酶 | R&D Systems | -- | |
| 奥利司他 | R&D Systems | -- | |
| 恩替卡韦 | R&D Systems | -- | |
| GSK-264220A | Tocris Bioscience | -- | |
| Myrcludex B | Cosmo Bio | -- | |
| Western blot | 抗DYKDDDDK (FLAG)抗体 | Cell Signaling Technology | #14793 |
| 抗ACTB抗体 | Cell Signaling Technology | #4970 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | #5147 | |
| 抗LIPG抗体 | Abcam | ab24447 | |
| 免疫荧光 | 抗GFP抗体 | Thermo Fisher Scientific | A-11122 |
| 抗HBV核心抗体 | Austral Biologicals | HBP-023-9 | |
| 抗HBV preS1抗体 | GenScript | -- | |
| ELISA | LIPG ELISA试剂盒 | MyBioSource | MBS2501814 |
| DNA提取 | DNeasy Blood & Tissue试剂盒 | QIAGEN | -- |
| DNA处理 | T5核酸外切酶 | New England BioLabs | -- |
| qPCR | qPCR预混液 | Nippon Gene | -- |
| RNA提取 | GenElute哺乳动物总RNA小提试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| cDNA合成 | High-Capacity cDNA反转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| qRT-PCR | 7500实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| 蛋白裂解 | RIPA裂解液 | EMD Millipore | -- |
| Complete蛋白酶抑制剂混合物 | Roche Applied Science | -- | |
| 蛋白分级 | EzSubcell提取试剂盒 | ATTO | -- |
| Western blot | Blocking One封闭液 | Nacalai Tesque | -- |
| ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫沉淀 | Protein G Mag Sepharose磁珠 | GE Healthcare | -- |
| 免疫荧光 | PLUS防淬灭封片剂（含DAPI） | Vector Laboratories | -- |
| HiBiT检测 | Nano Glo HiBiT裂解检测系统 | Promega | -- |
| GloMax-Multi+多功能检测系统 | Promega | -- | |
| HiBiT实验 | 人硫酸乙酰肝素ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| 重组人LIPG蛋白 | Abcam | -- | |
| 统计分析 | Prism 7软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LIPG表达与HBV感染实验 | 细胞系（HC1、PXB等）、LIPG shRNA序列、转导时间和MOI、HBV感染复数（MOI）和感染时间 阅读提示：Methods: Knockdown (KD) of LIPG by shRNA, 图1C-E |
| HBV附着实验 | 细胞类型（HepG2-NTCP-C4, Huh7-NTCP-YFP）、LIPG过表达或敲低状态、HBV吸附时间（1小时）和温度（4°C）、肝素/肝素酶浓度和处理时间、培养基更换条件 阅读提示：Methods: Cell lines, 图2C-D, 图3A-E |
| preS1探针结合实验 | Huh7-NTCP-YFP或LIPG KO细胞、TAMRA标记的preS1探针浓度（40 nM）、孵育时间（30分钟）和温度（37°C）、肝素或Myrcludex B浓度 阅读提示：Methods: PreS1 binding assay, 图6 |
| HiBiT结合实验 | HSPGs来源（细胞裂解液）、重组LIPG蛋白浓度（100 μg/well）、HiBiT-HBVcc拷贝数（10,000拷贝）、孵育时间（90分钟）和温度（37°C） 阅读提示：Methods: Establishment of the HiBiT assay system, 图5 |
| LIPG脂肪酶活性实验 | LIPG抑制剂（GSK-264220A和orlistat）的使用浓度和处理时间（1小时或2天） 阅读提示：Methods: Reagents and antibodies, 图7 |
| 长期LIPG抑制实验 | PXB细胞培养条件、shRNA转导效率、ETV浓度和给药时间、HBV感染时间（4周） 阅读提示：Methods: Cell lines, 图8E-H |