临床样本多组学分析
鉴定与舒尼替尼治疗反应相关的基因组、转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组特征。
收集115例ccRCC患者的肿瘤和癌旁组织，进行全外显子测序（n=113）、转录组测序（n=94）、蛋白质组（n=115）和磷酸化蛋白质组（n=66）分析。
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透明细胞肾细胞癌对酪氨酸激酶抑制剂反应的蛋白质基因组学
Proteogenomics of clear cell renal cell carcinoma response to tyrosine kinase inhibitor.
实验完整度
高包含患者队列多组学分析、体外细胞功能验证、机制验证（SP1降解、7q基因过表达）及独立队列验证。
主要模型
786-O细胞系 ACHN细胞系 769-P细胞系 115例接受舒尼替尼治疗的ccRCC患者队列
重点核对
患者队列：115例ccRCC患者，分为应答者（n=27）和无应答者（n=88） 舒尼替尼处理浓度：200 nM，AA处理浓度：100 μM VHL敲低效率：80% pS6K免疫组化验证：非应答者3例，应答者3例 多组学分类器性能：ROC-AUC=0.98（测试队列）
摘要
酪氨酸激酶抑制剂（TKI）舒尼替尼是晚期肾细胞癌的获批疗法之一。在此，我们对接受舒尼替尼治疗的透明细胞肾细胞癌（ccRCC）患者的115个肿瘤进行蛋白质基因组学分析，揭示了TKI治疗不同临床结局的分子基础。我们发现，染色体7q获得诱导的mTOR信号激活与舒尼替尼治疗的不良预后相关，而马兜铃酸特征和VHL突变协同增强糖酵解与更好的预后相关。蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析进一步强调了mTOR信号在舒尼替尼无应答中的作用。免疫图谱表征揭示了ccRCC中多样化的肿瘤微环境亚型。最后，我们构建了一个多组学分类器，可以检测应答者和无应答者（受试者工作特征曲线下面积，0.98）。我们的研究强调了ccRCC分子特征与TKI反应之间的关联，这有助于未来改善治疗反应。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究中国ccRCC患者对舒尼替尼治疗反应差异的分子基础，并构建预测反应的多组学分类器。
- 核心机制
- 染色体7q获得通过顺式调控LAMTOR4、MDH2和CALU激活mTOR信号，导致舒尼替尼耐药；马兜铃酸特征通过SP1降解下调磷酸戊糖途径，增强糖酵解，并与VHL突变协同改善预后。
- 主要证据
- 基于115例患者的多组学数据、体外细胞实验（786-O和ACHN细胞）验证AA和7q基因对mTOR及糖酵解的影响，以及pS6K免疫组化验证。
- 研究意义
- 研究结果为ccRCC的个性化治疗提供了分子依据，构建的多组学分类器有助于临床精准用药。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
突变特征分析
评估马兜铃酸特征对舒尼替尼治疗结局的影响。
利用COSMIC数据库分解突变特征，比较有无AA特征患者的生存和蛋白质组差异。
体外细胞实验验证AA效应
验证AA对舒尼替尼抑制肿瘤细胞增殖和侵袭的增强作用及其机制。
在786-O和ACHN细胞中，用AA（100 μM）和舒尼替尼（200 nM）处理，检测细胞增殖（CCK-8）、侵袭（Transwell）、PPP酶表达和SP1降解。
拷贝数改变分析
鉴定与舒尼替尼反应相关的染色体拷贝数改变及其对mTOR信号的影响。
使用GISTIC分析SCNAs，比较应答者和无应答者的CNA差异，并验证7q获得基因（LAMTOR4、MDH2、CALU）对mTOR信号的影响。
基因突变分析
鉴定与舒尼替尼反应相关的基因突变及其功能影响。
比较应答者和无应答者的突变基因，并验证VHL和KMT2C突变对糖酵解和预后的影响。
蛋白质组和磷酸化蛋白质组差异分析
鉴定与舒尼替尼反应相关的蛋白质和激酶活性差异。
使用GSEA和KSEA分析比较应答者和无应答者的蛋白质组和磷酸化蛋白质组，并验证mTOR和MAPK信号激活与耐药的关系。
免疫微环境亚型鉴定
探索肿瘤免疫微环境与舒尼替尼反应的关系。
使用xCell和ESTIMATE分析免疫细胞浸润，共识聚类鉴定三种免疫亚型。
构建多组学分类器
构建并验证预测舒尼替尼反应的多组学分类器。
使用随机森林模型整合蛋白质组、转录组、临床和基因组特征，并在独立测试队列中验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
样本和多组学测序
突变和拷贝数分析
差异表达和通路富集分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取和WES | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| DNA定量 | Qubit 3.0荧光计 | Life Technologies | -- |
| DNA片段化 | Covaris M220系统 | Covaris | -- |
| DNA文库构建 | Accel-NGS 2S HYB DNA文库构建试剂盒 | Swift Biosciences | 23096 |
| Accel-NGS 2S MID S1-S4 | Swift Biosciences | 279384 | |
| 外显子组富集 | xGen外显子组研究面板v1.0 | IDT | 1056115 |
| xGen Lockdown试剂 | IDT | 1072281 | |
| 文库纯化 | Dynabeads M-270链霉亲和素 | Thermo Fisher | 65306 |
| 文库扩增 | P5/P7引物 | Nanodigmbio | ND10010 |
| HotStart ReadyMix | KAPA | KK2612 | |
| 文库纯化 | SPRISELECT | Beckman | B23319 |
| DNA质量评估 | Bioanalyzer高灵敏度DNA分析试剂盒 | Agilent Technologies | 5067-4626 |
| DNA测序 | Nextseq CN500平台 | Illumina | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA测序 | TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS | Illumina | -- |
| 蛋白提取 | Bradford蛋白检测 | TaKaRa | T9310A |
| 磷酸化肽段富集 | High-Select™ Fe-NTA磷酸化肽段富集试剂盒 | Thermo Fisher | A32992 |
| 质谱分析 | Q Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| EASY-nLC 1200系统 | Thermo Fisher | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | -- |
| RPMI 1640培养基 | Invitrogen | -- | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 过表达质粒 | SP1过表达质粒 | GeneChem | -- |
| LAMTOR4、CALU、MDH2、TBL2、POR过表达质粒 | Tsingke Biotechnology | -- | |
| Transwell实验 | Matrigel基质胶 | BD | 356234 |
| Transwell小室 | Corning | 3422 | |
| 结晶紫 | Solarbio | G1063 | |
| 细胞增殖检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo Laboratories | -- |
| Western blot | G6PD抗体 | Proteintech | 25413-1-AP |
| PGD抗体 | Proteintech | 14718-1-AP | |
| TKT抗体 | Invitrogen | PA5-56165 | |
| LAMTOR4抗体 | Invitrogen | PA5-54301 | |
| MDH2抗体 | Abclonal | A13516 | |
| CALU抗体 | Abclonal | A6538 | |
| S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 5707 | |
| pS6K抗体 | Cell Signaling Technology | 9209 | |
| VHL抗体 | Abcam | ab270968 | |
| Actin抗体 | Genscript | A00702 | |
| Typhoon FLA 9500仪器 | GE Healthcare | -- | |
| 免疫组化 | 抗磷酸化p70 S6激酶抗体 | Abclonal | AP0502 |
| 乳酸检测 | L-乳酸比色检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K044-S |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者队列 | 样本量115例，应答者27例，无应答者88例；治疗前未接受其他治疗；舒尼替尼初始剂量50mg口服，每日一次，连用4周停2周 阅读提示：Methods: Clinical sample collection |
| 体外AA处理 | AA浓度100 μM；舒尼替尼浓度200 nM 阅读提示：Methods: AA concentration used in vitro assay; Sunitinib concentration used in vitro assay |
| VHL敲低实验 | VHL敲低效率80%；在ACHN细胞中 阅读提示：Results 图4g,h; Methods: RNA interference |
| 7q基因过表达实验 | LAMTOR4、MDH2、CALU过表达；在786-O和769-P细胞中 阅读提示：Results 图3e,g; Methods: Plasmid transfection |
| 免疫组化 | pS6K抗体稀释1:100；样本：非应答者3例，应答者3例 阅读提示：Methods: IHC |
| 多组学分类器 | 训练队列70%，测试队列30%；多组学特征：18个蛋白质、临床特征（LDH、肿瘤大小、PLT）、突变（VHL、KMT2C）、突变特征（AA）、CNA（7q、3p）、转录组（MIR3939等） 阅读提示：Methods: Classifier construction; Results 图7 |