建立BLS模型并评估ZIKV感染对迁移的影响
验证ZIKV感染是否影响滋养层细胞迁移和附着。
从Sw.71细胞构建胚泡样结构（BLS），用ZIKV（柬埔寨株和巴西株）处理，观察附着和迁移，并量化迁移距离。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Twist1-IRF9相互作用是干扰素刺激基因抗寨卡病毒感染所必需的
Twist1-IRF9 Interaction Is Necessary for IFN-Stimulated Gene Anti-Zika Viral Infection.
实验完整度
高包含体外细胞模型（Sw.71、BLS、CRISPR敲除）、体内小鼠模型、人胎盘样本、转录组测序及功能回补和免疫共沉淀验证。
主要模型
人滋养层细胞系Sw.71 Sw.71来源的胚泡样结构（BLS） 妊娠小鼠模型 人早期胎盘组织
重点核对
ZIKV感染（柬埔寨株和巴西株）剂量和时间 IFNβ处理浓度（3、30 ng/ml）和时间 Poly IC处理剂量（20 μg/kg）和时间 CRISPR/Cas9敲除Twist1的效率（91.1%）及克隆验证
摘要
针对病原体的有效免疫防御需要足够的基线感应机制，以便能够迅速作出反应。I型干扰素对急性病毒感染具有保护作用，并对病毒和细菌感染作出反应，但其功效取决于组成型基础活性，该活性促进下游基因（称为干扰素刺激基因（ISG））的表达。I型干扰素和ISG以低水平组成型产生，然而它们发挥深远的影响，对许多基本的生理过程至关重要，这些过程超越抗病毒和抗菌防御，包括免疫调节、细胞周期调节、细胞存活和细胞分化。尽管I型干扰素的经典反应途径已被广泛表征，但关于组成型ISG表达的转录调控知之甚少。寨卡病毒感染是人类妊娠并发症和胎儿发育的主要风险，并且依赖于适当的IFNβ反应。然而，目前尚不清楚ZIKV如何在IFNβ反应的情况下导致流产。我们揭示了在早期抗病毒反应背景下这一功能的一种机制。我们的结果表明，IRF9在人滋养层中对ZIKV感染的早期反应至关重要。此功能取决于IRF9与Twist1的结合。在此信号级联中，Twist1不仅是促进IRF9与ISRE结合的必需伙伴，而且是控制IRF9基础水平的上游调节因子。Twist1的缺失使人滋养层细胞易受ZIKV感染。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ZIKV感染如何逃逸I型干扰素反应并导致流产，以及Twist1在其中的作用机制。
- 核心机制
- Twist1与IRF9直接结合，促进IRF9与ISRE结合并维持基础ISG表达，从而提供早期抗病毒保护；IFNβ诱导的Twist1降解释放IRF9以形成ISGF3复合物。
- 主要证据
- CRISPR敲除Twist1降低IRF9和ISG基础表达并增加ZIKV易感性；Twist1和IRF9共转染恢复ISRE活性；免疫共沉淀证实Twist1-IRF9相互作用。
- 研究意义
- 揭示Twist1-IRF9相互作用维持基础ISG表达的新机制，为理解早期抗病毒防御和ZIKV感染导致的妊娠并发症提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测Twist1在胎盘和滋养层细胞中的表达
确定Twist1在胎盘组织及滋养层细胞中的表达模式。
通过免疫组化检测早孕胎盘组织，通过Western blot检测滋养层细胞系和BLS中的Twist1表达。
评估ZIKV感染和IFNβ对Twist1表达的影响
验证ZIKV感染或IFNβ处理是否下调Twist1表达。
用ZIKV或Poly IC感染/处理Sw.71细胞，检测Twist1 mRNA和蛋白水平；用IFNβ处理Sw.71细胞，检测Twist1表达变化及BLS迁移。
敲除Twist1并表征细胞表型
确定Twist1在滋养层迁移、侵袭和抗病毒反应中的必要性。
用CRISPR/Cas9在Sw.71细胞中敲除Twist1，验证敲除效率，检测BLS迁移和侵袭能力，并进行ZIKV感染。
转录组分析Twist1下游通路
鉴定Twist1调控的基因和通路。
对WT和TWKO细胞进行RNA-seq，筛选差异表达基因并进行通路富集分析。
验证IFNβ信号通路完整性
确定Twist1在IFNβ信号通路中的作用位置。
用IFNβ处理WT和TWKO细胞，检测STAT1/STAT2磷酸化、IRF9表达和ISG表达。
确定Twist1与IRF9的相互作用机制
验证Twist1与IRF9的蛋白相互作用及其对ISRE转录活性的影响。
在TWKO细胞中共转染Twist1突变体和IRF9，检测ISRE荧光素酶活性；通过免疫共沉淀验证Twist1-IRF9结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Life Technologies | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Life Technologies | -- | |
| CRISPR/Cas9敲除 | lentiCRISPRv2GFP质粒 | Addgene | #82416 |
| pCMV-VSV-G包装质粒 | Addgene | #8454 | |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | #12260 | |
| 聚乙烯亚胺 | -- | -- | |
| 免疫组织化学 | Twist1抗体 | Proteintech | 25465-1-AP |
| UltraTek多价可视化系统 | SkyTec Laboratories | -- | |
| 生物素封闭试剂盒 | SkyTec Laboratories | -- | |
| 超级封闭液 | SkyTec Laboratories | -- | |
| 免疫细胞化学 | HLA-G抗体 | Elabscience | E-AB-18031 |
| HLA-C抗体 | Elabscience | E-AB-17922 | |
| 山羊抗兔IgG AF488 | Elabscience | E-AB-1055 | |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| 无RNA酶DNA酶试剂盒 | Qiagen | -- | |
| RT-qPCR | TaqMan一步法RT-PCR | Applied Biosystems | -- |
| CFX Connect实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| RNA测序 | NEBNext Ultra II RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| Qubit 2.0荧光计 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| TapeStation | Agilent Technologies | -- | |
| Illumina HiSeq | Illumina | -- | |
| 荧光素酶报告 | ISRE报告基因试剂盒 | BPS Bioscience | cat#60613 |
| FuGENE 6转染试剂 | Promega | Cat.# E2691 | |
| 细胞因子检测 | Luminex多重检测 | R&D Systems | -- |
| 统计分析 | Prism软件 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与病毒感染 | 细胞系来源（Sw.71、HESC），培养基成分，ZIKV感染MOI和感染时间（1小时），感染后孵育时间（48小时），以及细胞密度（1.5×10^5/孔） 阅读提示：Methods: Cell Culture, Viral infections |
| BLS形成与迁移实验 | BLS形成时细胞数（4000），培养时间（48小时），转移至组织培养板后的观察时间（24小时），以及ZIKV预处理浓度和时间 阅读提示：Methods: Formation of Blastocyst-Like Spheroids; Figure 1 legend |
| CRISPR/Cas9敲除Twist1 | gRNA序列，载体（lentiCRISPRv2GFP），包装质粒（pCMV-VSV-G, psPAX2），转染试剂（PEI），以及敲除效率验证（Sanger测序，TIDE分析） 阅读提示：Methods: Knockout of Twist1 using CRISPR/Cas9 |
| IFNβ处理实验 | IFNβ浓度（3和30 ng/ml）和处理时间（24小时以及2、8、16小时的时间进程），检测的mRNA和蛋白（Twist1, ISGs） 阅读提示：Figure 5 legend; Supp. Fig. 1 |
| 荧光素酶报告基因实验 | ISRE报告质粒的使用，转染试剂（FuGENE 6），转染后培养时间（24小时），以及共转染的Twist1和IRF9质粒 阅读提示：Methods: Luciferase assay; Figure 11 legend |