SENP3和USP7调控Polycomb-rixosome相互作用及沉默功能

SENP3 and USP7 regulate Polycomb-rixosome interactions and silencing functions.

作者信息Haining Zhou, Wenzhi Feng, Juntao Yu, Tiasha A Shafiq, Joao A Paulo, Jiuchun Zhang, Zhenhua Luo, Steven P Gygi, Danesh Moazed
PMID37014752
期刊Cell Rep
发布时间2023-04-25
DOI10.1016/j.celrep.2023.112339

实验完整度

高

研究包含多个独立证据层级:RNA-seq、ChIP-seq、免疫共沉淀、质谱、蔗糖梯度沉降、异位报告基因实验,并进行了功能验证和机制验证。

主要模型

HEK293FT细胞 人胚胎干细胞(hESCs) 异位报告基因细胞系(5xtetO-CTRN)

重点核对

SENP3的催化活性(C532A突变)对rixosome与PRC1结合的影响 USP7抑制剂FT671处理浓度和时间 siRNA敲低SENP3和USP7后基因表达变化 ChIP-qPCR检测异位位点RING1B、BMI1、TEX10的富集

摘要

The rixosome and PRC1 silencing complexes are associated with deSUMOylating and deubiquitinating enzymes, SENP3 and USP7, respectively. How deSUMOylation and deubiquitylation contribute to rixosome- and Polycomb-mediated silencing is not fully understood. Here, we show that the enzymatic activities of SENP3 and USP7 are required for silencing of Polycomb target genes. SENP3 deSUMOylates several rixosome subunits, and this activity is required for association of the rixosome with PRC1. USP7 associates with canonical PRC1 (cPRC1) and deubiquitinates the chromodomain subunits CBX2 and CBX4, and inhibition of USP activity results in disassembly of cPRC1. Finally, both SENP3 and USP7 are required for Polycomb- and rixosome-dependent silencing at an ectopic reporter locus. These findings demonstrate that SUMOylation and ubiquitination regulate the assembly and activities of the rixosome and Polycomb complexes and raise the possibility that these modifications provide regulatory mechanisms that may be utilized during development or in response to environmental challenges.

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
去SUMO化和去泛素化如何调控rixosome和Polycomb复合物的功能?
核心机制
SENP3通过去SUMO化几个rixosome亚基,促进rixosome与PRC1的相互作用;USP7与cPRC1结合,去泛素化CBX2和CBX4,维持cPRC1复合物的完整性。
主要证据
RNA-seq显示SENP3或USP7敲低上调Polycomb靶基因;免疫共沉淀和质谱显示SENP3活性对rixosome-PRC1结合必需,USP7抑制导致cPRC1亚基解离;异位报告基因实验证实两者对沉默功能必需。
研究意义
这些发现表明SUMO化和泛素化调节rixosome和Polycomb复合物的组装与活性,为发育或环境挑战下的调控机制提供可能,并提示SENP3和USP7可作为抗癌药物靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

验证SENP3对Polycomb靶基因沉默的需求

确定SENP3及其去SUMO化活性是否参与Polycomb靶基因的沉默。

在HEK293FT细胞中用siRNA敲低SENP3,进行RNA-seq分析;并表达SENP3野生型或C532A催化失活突变体进行回补。

2

检测SENP3对rixosome染色质定位及与PRC1结合的影响

探究SENP3是否影响rixosome在染色质上的定位及其与PRC1的相互作用。

通过ChIP-seq检测TEX10和RING1B的富集,通过免疫共沉淀分析rixosome亚基(TEX10、NOL9、WDR18)与PRC1亚基(RING1B、BMI1)的相互作用。

3

验证USP7与cPRC1的关联及其对沉默的需求

确定USP7是否与经典PRC1复合物相关,以及其去泛素化活性是否影响Polycomb靶基因沉默。

通过内源Flag标签的CBX2、CBX4和PHC2进行免疫沉淀-质谱分析,并利用siRNA敲低USP7和USP7抑制剂FT671处理进行RNA-seq分析。

4

探究USP7对cPRC1完整性的调控

研究USP7去泛素化活性是否维持PRC1复合物的完整性。

使用USP7抑制剂处理细胞,通过免疫印迹检测cPRC1亚基的迁移变化,通过免疫共沉淀分析PRC1亚基间的相互作用,并通过ChIP-seq检测H2AK119ub1、CBX2、BMI1和PCGF1的染色质富集。

5

在异位报告基因位点验证SENP3和USP7的功能

确证SENP3和USP7在异位Polycomb沉默中的必要性及催化活性的作用。

使用携带5xtetO-CTRN报告基因的细胞系,通过四环素诱导RING1B拴系,在释放后敲低SENP3或USP7,并检测报告基因沉默和TEX10的招募。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基----
胎牛血清----
FT671MedChemExpressHY-107985
P5091MedChemExpressHY-15667
P22077Cayman Chemical23704
HBX19818MedChemExpressHY-17540
HBX41108Cayman Chemical23759
MG132SigmaM8699-1MG
Lipofectamine RNAiMAX转染试剂Invitrogen--
Dynabeads Protein A/G磁珠ThermoFisher--
DNA酶I----
抗Flag磁珠SigmaM8823
3×Flag肽APExBIOA6001
RNeasy Plus试剂盒Qiagen74134
逆转录试剂盒ThermoFisher18090010
QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR系统Applied Biosystems--
RNA纯化试剂盒Qiagen74134
二甲基庚二酸二甲酯ThermoFisher--
甲醛ThermoFisher--
胰蛋白酶Gibco--
Branson超声破碎仪----
PCR纯化试剂盒QIAGEN28106
TruSeq DNA样本制备试剂盒Illumina--
Illumina Hiseq 2500测序仪Illumina--
Q Exactive质谱仪Thermo Fisher Scientific--
StrataClean树脂Agilent400714
抗RING1B抗体Cell Signaling Technology5694S
抗CBX2抗体Proteintech15579-1-AP
抗SENP3抗体Cell Signaling Technology5591S
抗USP7抗体Cell Signaling Technology4833T
抗Flag抗体SigmaF3165
抗TEX10抗体ThermoFisher720257
抗H2AK119ub1抗体Cell Signaling Technology8240T

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
HEK293FT细胞培养条件:DMEM+10%胎牛血清;hESC培养条件:matrigel包被平板、E8培养基。
阅读提示:STAR Methods, Cell lines
siRNA敲低
siRNA浓度200 nM,转染试剂Lipofectamine RNAiMAX,转染时间未明确(一般3天)。
阅读提示:STAR Methods, RNAi
USP7抑制
FT671浓度1 μM,处理时间1天;其他抑制剂浓度:P5091、P22077、HBX19818、HBX41108均为20 μM。
阅读提示:STAR Methods, USP7 inhibition
免疫共沉淀
细胞裂解缓冲液、IP缓冲液组成,DNase I消化条件(2小时,4°C),抗体用量(未明确)。
阅读提示:STAR Methods, Immunoprecipitation and mass spectrometry analysis
ChIP
交联条件:10 mM DMP 30分钟,1%甲醛15分钟;超声条件:Branson超声仪,片段大小100-800 bp;抗体量3 μg。
阅读提示:STAR Methods, ChIP-qPCR, ChIP-seq