验证SENP3对Polycomb靶基因沉默的需求
确定SENP3及其去SUMO化活性是否参与Polycomb靶基因的沉默。
在HEK293FT细胞中用siRNA敲低SENP3,进行RNA-seq分析;并表达SENP3野生型或C532A催化失活突变体进行回补。
SENP3 and USP7 regulate Polycomb-rixosome interactions and silencing functions.
研究包含多个独立证据层级:RNA-seq、ChIP-seq、免疫共沉淀、质谱、蔗糖梯度沉降、异位报告基因实验,并进行了功能验证和机制验证。
HEK293FT细胞 人胚胎干细胞(hESCs) 异位报告基因细胞系(5xtetO-CTRN)
SENP3的催化活性(C532A突变)对rixosome与PRC1结合的影响 USP7抑制剂FT671处理浓度和时间 siRNA敲低SENP3和USP7后基因表达变化 ChIP-qPCR检测异位位点RING1B、BMI1、TEX10的富集
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定SENP3及其去SUMO化活性是否参与Polycomb靶基因的沉默。
在HEK293FT细胞中用siRNA敲低SENP3,进行RNA-seq分析;并表达SENP3野生型或C532A催化失活突变体进行回补。
探究SENP3是否影响rixosome在染色质上的定位及其与PRC1的相互作用。
通过ChIP-seq检测TEX10和RING1B的富集,通过免疫共沉淀分析rixosome亚基(TEX10、NOL9、WDR18)与PRC1亚基(RING1B、BMI1)的相互作用。
确定USP7是否与经典PRC1复合物相关,以及其去泛素化活性是否影响Polycomb靶基因沉默。
通过内源Flag标签的CBX2、CBX4和PHC2进行免疫沉淀-质谱分析,并利用siRNA敲低USP7和USP7抑制剂FT671处理进行RNA-seq分析。
研究USP7去泛素化活性是否维持PRC1复合物的完整性。
使用USP7抑制剂处理细胞,通过免疫印迹检测cPRC1亚基的迁移变化,通过免疫共沉淀分析PRC1亚基间的相互作用,并通过ChIP-seq检测H2AK119ub1、CBX2、BMI1和PCGF1的染色质富集。
确证SENP3和USP7在异位Polycomb沉默中的必要性及催化活性的作用。
使用携带5xtetO-CTRN报告基因的细胞系,通过四环素诱导RING1B拴系,在释放后敲低SENP3或USP7,并检测报告基因沉默和TEX10的招募。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| USP7抑制 | FT671 | MedChemExpress | HY-107985 |
| P5091 | MedChemExpress | HY-15667 | |
| P22077 | Cayman Chemical | 23704 | |
| HBX19818 | MedChemExpress | HY-17540 | |
| HBX41108 | Cayman Chemical | 23759 | |
| 蛋白降解抑制 | MG132 | Sigma | M8699-1MG |
| RNA干扰 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 免疫沉淀 | Dynabeads Protein A/G磁珠 | ThermoFisher | -- |
| DNA酶I | -- | -- | |
| 蔗糖梯度沉降 | 抗Flag磁珠 | Sigma | M8823 |
| 3×Flag肽 | APExBIO | A6001 | |
| RT-qPCR | RNeasy Plus试剂盒 | Qiagen | 74134 |
| 逆转录试剂盒 | ThermoFisher | 18090010 | |
| QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| RNA-seq | RNA纯化试剂盒 | Qiagen | 74134 |
| ChIP | 二甲基庚二酸二甲酯 | ThermoFisher | -- |
| 甲醛 | ThermoFisher | -- | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | -- | |
| Branson超声破碎仪 | -- | -- | |
| PCR纯化试剂盒 | QIAGEN | 28106 | |
| ChIP-seq | TruSeq DNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
| Illumina Hiseq 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| 质谱分析 | Q Exactive质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白质捕获 | StrataClean树脂 | Agilent | 400714 |
| 抗体 | 抗RING1B抗体 | Cell Signaling Technology | 5694S |
| 抗CBX2抗体 | Proteintech | 15579-1-AP | |
| 抗SENP3抗体 | Cell Signaling Technology | 5591S | |
| 抗USP7抗体 | Cell Signaling Technology | 4833T | |
| 抗Flag抗体 | Sigma | F3165 | |
| 抗TEX10抗体 | ThermoFisher | 720257 | |
| 抗H2AK119ub1抗体 | Cell Signaling Technology | 8240T |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HEK293FT细胞培养条件:DMEM+10%胎牛血清;hESC培养条件:matrigel包被平板、E8培养基。 阅读提示:STAR Methods, Cell lines |
| siRNA敲低 | siRNA浓度200 nM,转染试剂Lipofectamine RNAiMAX,转染时间未明确(一般3天)。 阅读提示:STAR Methods, RNAi |
| USP7抑制 | FT671浓度1 μM,处理时间1天;其他抑制剂浓度:P5091、P22077、HBX19818、HBX41108均为20 μM。 阅读提示:STAR Methods, USP7 inhibition |
| 免疫共沉淀 | 细胞裂解缓冲液、IP缓冲液组成,DNase I消化条件(2小时,4°C),抗体用量(未明确)。 阅读提示:STAR Methods, Immunoprecipitation and mass spectrometry analysis |
| ChIP | 交联条件:10 mM DMP 30分钟,1%甲醛15分钟;超声条件:Branson超声仪,片段大小100-800 bp;抗体量3 μg。 阅读提示:STAR Methods, ChIP-qPCR, ChIP-seq |