计算机模拟筛选FoxO1激动剂
从已知化合物中筛选出与FoxO1结合亲和力最高的候选化合物。
使用AutoDock Vina 1.1.2对11个化合物进行分子对接，计算结合自由能，并通过PyMol可视化相互作用。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
一种新型FoxO1激动剂通过下调BACE1降低Aβ水平的计算机模拟与体外实验分析
In silico and in vitro analyses of a novel FoxO1 agonist reducing Aβ levels via downregulation of BACE1.
实验完整度
中包含分子对接、分子动力学模拟等计算机模拟实验，以及SH-SY5Y细胞中的Western blotting、RT-qPCR、ELISA等功能和机制验证，但缺乏体内动物模型验证。
主要模型
SH-SY5Y细胞
重点核对
计算机筛选的FoxO1结构（PDB: 4lg0） SH-SY5Y细胞处理浓度（0, 20, 40, 60, 80, 100 μM）及时间（24 h） FoxO1下游靶基因（P21、BIM、PPARγ）的表达变化 BACE1、APP、ADAM10、PS1的蛋白表达水平 Aβ1-40和Aβ1-42的水平（细胞内和培养基中）
摘要
目的：FoxO1是治疗阿尔茨海默病（AD）的重要靶点。然而，FoxO1特异性激动剂及其对AD的作用尚未见报道。本研究旨在鉴定能够上调FoxO1活性以缓解AD症状的小分子化合物。方法：通过计算机模拟筛选和分子动力学模拟鉴定FoxO1激动剂。分别使用Western blotting和逆转录定量聚合酶链反应检测SH-SY5Y细胞中FoxO1下游P21、BIM和PPARγ的蛋白和基因表达水平。采用Western blotting和酶联免疫吸附试验探讨FoxO1激动剂对APP代谢的影响。结果：N-(3-甲基异噻唑-5-基)-2-(2-氧代苯并[d]噁唑-3(2H)-基)乙酰胺（化合物D）与FoxO1具有最高的亲和力。化合物D激活FoxO1并调节其下游靶基因P21、BIM和PPARγ的表达。在化合物D处理的SH-SY5Y细胞中，BACE1表达水平下调，Aβ1-40和Aβ1-42的水平也降低。结论：我们提出了一种新型小分子FoxO1激动剂，具有良好的抗AD效果。本研究为AD新药发现提供了一种有前景的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 寻找能够激活FoxO1的小分子激动剂，并评估其通过调节BACE1降低Aβ水平、改善阿尔茨海默病症状的潜力。
- 核心机制
- 化合物D作为FoxO1激动剂，直接激活FoxO1，导致其下游靶基因（如P21、BIM）表达上调和PPARγ下调，进而下调BACE1表达，减少Aβ1-40和Aβ1-42的产生。
- 主要证据
- 分子对接和分子动力学模拟显示化合物D与FoxO1稳定结合；在SH-SY5Y细胞中，化合物D浓度依赖性地上调FoxO1下游基因表达、下调BACE1蛋白水平，并降低Aβ1-40/42水平。
- 研究意义
- 该研究首次报道了特异性FoxO1激动剂化合物D，可能成为AD治疗的先导化合物，为靶向药物研究提供了新方法和策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分子动力学模拟验证
验证候选化合物与FoxO1结合的稳定性。
使用GROMACS 2019.6进行40 ns的分子动力学模拟，分析RMSD、RMSF和Rg。
细胞活性检测
评估化合物D对SH-SY5Y细胞活力和形态的影响。
使用CCK-8试剂盒检测细胞活力，并用倒置显微镜观察细胞形态。
验证FoxO1激活及其下游靶基因表达
验证化合物D是否激活FoxO1及其下游靶基因的表达。
使用RT-qPCR和Western blotting检测SH-SY5Y细胞中FoxO1、P21、BIM、PPARγ和p-FoxO1的表达。
检测BACE1及APP代谢相关蛋白
探索化合物D对APP代谢途径的影响。
使用Western blotting检测APP、BACE1、ADAM10和PS1的蛋白水平。
检测Aβ水平
评估化合物D对Aβ生成的影响。
使用ELISA检测细胞和培养基中Aβ1-40和Aβ1-42的水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 计算机模拟 | AutoDock Vina 1.1.2 | -- | -- |
| PyMol 2.4.0版 | -- | -- | |
| 分子动力学模拟 | GROMACS 2019.6版 | -- | -- |
| 药物制备 | 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素混合液 | Gibco | -- | |
| 细胞形态观察 | 倒置显微镜Ts2R-FL | Nikon | -- |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | MedChemExpress | HY-K0301 |
| RT-qPCR | RNAiso Plus | Takara Biotechnology | 9108 |
| PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara Biotechnology | RR047A | |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara Biotechnology | RR820A | |
| QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blotting | 抗FoxO1抗体 | Cell Signaling Technology | 2880S |
| 抗P21抗体 | Cell Signaling Technology | 2947S | |
| 抗BIM抗体 | Proteintech | 22037-1-AP | |
| 抗PPARγ抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7273 | |
| 抗BACE1抗体 | Cell Signaling Technology | 5606S | |
| 抗APP抗体 | Sigma-Aldrich | A8717 | |
| 抗ADAM10抗体 | Cell Signaling Technologies | 14194S | |
| 抗PS1抗体 | Abcam | ab176560 | |
| 抗p-FoxO1抗体 | Cell Signaling Technology | 9461S | |
| 抗GAPDH抗体 | Abways Technology | AB0037 | |
| 增强化学发光底物 | Milipore | WBKLS100 | |
| 凝胶成像系统（chemi XX9） | Syngene | -- | |
| ELISA | 人Aβ1-40 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H0542c |
| 人Aβ1-42 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H0543c |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 分子对接 | FoxO1蛋白结构（PDB: 4lg0）、候选化合物结构、对接软件（AutoDock Vina）参数 阅读提示：Methods 2.1 Molecular docking |
| 分子动力学模拟 | 模拟温度（305 K）、压力（101 kPa）、模拟时间（40 ns）、记录间隔（10 ps） 阅读提示：Methods 2.2 Molecular dynamics simulation validation by GROMACS |
| 细胞培养与处理 | SH-SY5Y细胞来源、培养基（DMEM/F12+10% FBS）、处理浓度（0-100 μM）、处理时间（24 h） 阅读提示：Methods 2.4 Cell culture 和 2.5 Cell morphology and cell viability assays |
| RT-qPCR | 引物序列（Table 1）、RNA提取试剂、逆转录试剂、PCR仪（QuantStudio 5）、反应程序 阅读提示：Methods 2.6 Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction |
| Western blotting | 抗体信息（品牌、货号、稀释比例）、蛋白上样量、电泳条件、转膜条件 阅读提示：Methods 2.7 Western blotting |
| ELISA | ELISA试剂盒（品牌、货号）、检测样品（细胞和培养基）、归一化方法 阅读提示：Methods 2.8 Measurement of Aβ levels using enzyme-linked immunosorbent assay |