建立并扩增人结肠3D类器官
获取来源于人横结肠活检组织的结肠隐窝干细胞培养物，用于后续单层分化。
从健康志愿者横结肠活检组织中分离隐窝，在扩增培养基中培养为3D结肠类器官，并在分化培养基中诱导分化4天。
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人结肠类器官-肌成纤维细胞共培养用于研究隐窝颈下部顶端Na+/H+交换体
Human Colonoid-Myofibroblast Coculture for Study of Apical Na+/H+ Exchangers of the Lower Cryptal Neck Region.
实验完整度
高包含人类结肠活检样本的3D类器官培养、2D单层共培养、免疫组化/免疫荧光、Western blot、RT-qPCR及功能荧光测量等多个独立证据层级，并进行功能验证。
主要模型
人横结肠活检来源的3D结肠类器官 结肠肌成纤维细胞共培养（CM-CE）单层 未分化（EM）和分化（DM）结肠类器官单层
重点核对
模型类型：CM-CE共培养（肌成纤维细胞在transwell底部，上皮细胞在滤膜上） 培养时间：共培养4天 抑制剂浓度：3 μM HOE642（抑制NHE8）、60 μM HOE642（抑制NHE2和NHE8）、3 μM HOE642 + 1 μM tenapanor（抑制NHE3和NHE8） pH恢复测量：BCECF荧光法，顶端Na+灌注 TEER测量：EVOM2伏欧表
摘要
结肠上皮细胞顶膜中的阳离子和阴离子转运沿着隐窝轴高度空间组织化。由于缺乏实验可及性，关于隐窝下部结肠上皮细胞顶膜离子转运体功能的信息很少。本研究的目的是建立一个结肠下隐窝区的体外模型，该模型表达过渡扩增/祖细胞（TA/PE），并且顶膜可及，以便对下隐窝表达的Na+/H+交换体（NHEs）进行功能研究。从人类横结肠活检组织中分离结肠隐窝和肌成纤维细胞，扩增为三维（3D）结肠类器官和肌成纤维细胞单层，并进行表征。建立了滤膜生长的结肠肌成纤维细胞-结肠上皮细胞（CM-CE）共培养体系（肌成纤维细胞在transwell底部，结肠上皮细胞在滤膜上）。将CM-CE单层的离子转运/连接/干细胞标志物的表达模式与未分化（EM）和分化（DM）结肠类器官单层进行比较。采用荧光pH i 测量表征顶端NHE。CM-CE共培养显示跨上皮电阻（TEER）快速增加，同时claudin-2下调。它们保持增殖活性和类似TA/PE细胞的表达模式。CM-CE单层表现出高顶端Na+/H+交换活性，其中>80%由NHE2介导。人结肠类器官-肌成纤维细胞共培养允许研究在隐窝颈部区域未分化结肠上皮细胞顶膜中表达的离子转运体。NHE2亚型是该上皮区室中主要的顶端Na+/H+交换体。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 建立一种人结肠隐窝下部区域的体外模型，使顶端膜可及，以功能性鉴定该区域表达的Na+/H+交换体亚型。
- 核心机制
- 在CM-CE共培养中，claudin-2的快速下调导致TEER快速增加；顶端Na+/H+交换活性主要由NHE2介导，NHE8贡献较小。
- 主要证据
- 通过荧光pH测量，在CM-CE单层中，顶端Na+依赖pH恢复率在60 μM HOE642（抑制NHE2和NHE8）下显著降低，而3 μM HOE642（抑制NHE8）和tenapanor（抑制NHE3）影响较小；计算得出NHE2占82%±10.7%，NHE8占21.7%±17.2%，NHE3占1.21%±12.9%。
- 研究意义
- 该共培养模型可用于研究人结肠隐窝颈部细胞的生长、分化、屏障功能和阴离子分泌功能，并有助于理解固有层-上皮相互作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立肌成纤维细胞单层共培养系统
模拟隐窝下部过渡扩增/祖细胞微环境，并获得高电阻单层以便进行顶膜功能研究。
从横结肠固有层分离肌成纤维细胞，培养至单层，然后将汇合的结肠类器官单层转移至含肌成纤维细胞的培养板中共培养4天。
表征CM-CE共培养单层
验证共培养单层的细胞类型和分化状态，确认其代表性。
通过TEER测量、免疫组化（KI67、MUC2）和RT-qPCR分析标志物（LGR5、KI67、NHE3等）表达。
检测紧密连接蛋白表达变化
解释CM-CE共培养TEER快速升高的分子机制。
通过RT-qPCR和免疫组化检测claudin-1、-2、-3、-4、-7、-8、ZO-1、occludin的表达。
功能测量顶端Na+/H+交换活性
鉴定CM-CE单层顶端膜上NHE亚型的相对贡献。
使用BCECF荧光法，通过顶端Na+灌注和不同NHE抑制剂（HOE642、tenapanor）评估pH恢复速率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Y-27632 | Tocris Bioscience | -- |
| CHIR-99021 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | -- | |
| 丙戊酸 | -- | -- | |
| EMEM培养基 | Lonza | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | -- | |
| 人IV型胶原蛋白 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | -- | -- | |
| Advanced DMEM/F12培养基 | -- | -- | |
| TEER测量 | EVOM2伏欧表 | World Precision Instruments | -- |
| 荧光pH测量 | BCECF-AM | Life Technologies GmbH | -- |
| 尼日利亚霉素 | -- | -- | |
| HOE642 | -- | -- | |
| 替那帕诺 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 正常山羊血清 | Thermo Fisher Scientific GmbH | 10000C |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| KI67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| MUC2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-515032 | |
| NHE3抗体 | Novus Biologicals | NBP1-82574 | |
| NHE8抗体 | Invitrogen | PA5-106749 | |
| SLC26A3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376187 | |
| SMA抗体 | Elabscience | E-AB-34268 | |
| CD90抗体 | EXBIO | 10-652-C025 | |
| claudin-2抗体 | Invitrogen | 32-5600 | |
| ZO-1抗体 | Invitrogen | 61-7300 | |
| Alexa Fluor 488二抗 | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 568二抗 | Invitrogen | A11011 | |
| DAPI | Carl Roth | 6843.2 | |
| 鬼笔环肽-Alexa Fluor 647 | Abcam | ab176759 | |
| Mowiol封片剂 | -- | -- | |
| 双面胶带 | Tesa | 05338 | |
| 共聚焦显微镜TCS SP8 | LEICA Microsystems | -- | |
| 免疫组织化学 | Tris缓冲液 | -- | -- |
| EDTA | -- | -- | |
| 氯化铵 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | -- | |
| Olympus FV1000共聚焦显微镜 | Evident Europe GmbH | -- | |
| RT-qPCR | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen GmbH | 74106 |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific GmbH | K1622 | |
| qPCRBIO SyGreen Mix Lo-ROX | Nippon Genetics | PB20.11-51 | |
| Western blot | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 4693159001 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific GmbH | 23225 | |
| PVDF膜 | Cytiva | 10600023 | |
| β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| HRP偶联二抗 | Invitrogen | G-21040 | |
| ECL化学发光液 | Cytiva | RPN2209 | |
| Fusion FX成像系统 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 3D类器官培养 | 培养基组成（EM含Y-27632、CHIR-99021和丙戊酸；DM不含L-WRN、SB202190、PGE2，含10% Noggin条件培养基），培养时间 阅读提示：Methods 4.1 |
| 肌成纤维细胞分离和培养 | 细胞来源（横结肠活检组织上皮去除后的固有层），培养基（EMEM含10% FBS等），传代数（6-12），接种密度（5.5×10^4细胞/孔） 阅读提示：Methods 4.1 |
| CM-CE共培养建立 | transwell规格（6.5mm直径，3µm孔聚酯膜），包被胶原IV浓度（10 mg/cm2），转移时机（TEER>150 Ω/cm2），共培养时间（4天） 阅读提示：Methods 4.1 |
| 顶端NHE活性测量 | BCECF-AM浓度（5 μM），顶端Na+灌注，基底侧无Na+含3 μM HOE642，抑制剂浓度（3 μM HOE642, 60 μM HOE642, 3 μM HOE642+1 μM tenapanor），pH恢复速率计算 阅读提示：Methods 4.2；图7 |