患者肠道隐窝上皮细胞分离与circRNA表达谱分析
鉴定腹部脓毒症患者肠道上皮中异常表达的circRNAs
利用激光捕获显微切割从4例肠穿孔致腹脓毒症患者和4例非脓毒症患者肠道隐窝获取纯化上皮细胞，提取RNA经RNase R消化后进行circRNA微阵列分析，筛选差异表达circRNAs。
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circFLNA通过海绵吸附miR-766-3p经Fas介导的凋亡通路促进腹部脓毒症期间的肠道损伤
circFLNA promotes intestinal injury during abdominal sepsis through Fas-mediated apoptosis pathway by sponging miR-766-3p.
实验完整度
高包含患者LCM联合circRNA微阵列、人肠上皮细胞系体外功能与机制验证（过表达/敲低、双荧光素酶、RIP）、小鼠CLP模型体内验证与生存分析等多名独立证据层级。
主要模型
HIEC-6细胞系（人小肠上皮细胞） C57BL/6小鼠盲肠结扎穿刺（CLP）模型 肠穿孔腹部脓毒症患者的肠道隐窝上皮细胞
重点核对
LPS处理HIEC-6细胞的最佳浓度50 μg/mL及处理时间24 h si-circFLNA#1和miR-766-3p inhibitor的转染浓度（50 nM） CLP手术的具体操作（盲肠中点结扎、20号针头贯穿2次） 小鼠分组：sham、CLP、CLP+si-NC+inhibitor-NC、CLP+si-NC+miR-766-3p inhibitor、CLP+si-circFLNA+inhibitor-NC、CLP+si-circFLNA+miR-766-3p inhibitor，每组n=25 miR-766-3p inhibitor注射剂量10 μg，si-circFLNA注射剂量10 μg，尾静脉注射，于CLP前24小时
摘要
背景：腹腔感染是重症监护室中脓毒症的第二常见原因。腹部脓毒症导致的肠道上皮损伤引发多种病理变化，如肠道细菌和毒素进入血液，导致持续性全身炎症和多器官功能障碍。脓毒症诱导的肠道上皮细胞凋亡增加进一步加剧了脓毒症的进展。尽管一些研究表明circRNA参与脓毒症中的肠道上皮损伤，但很少有研究确定circRNA在肠道上皮凋亡中的作用。方法：我们使用激光捕获显微切割从4例肠穿孔引起的腹部脓毒症患者和4例年龄和性别匹配的非脓毒症患者中获取位于肠道隐窝的纯化上皮细胞。对circRNA进行微阵列分析以评估脓毒症患者和非脓毒症患者之间差异表达的circRNA。最后，进行体外和体内实验以研究circFLNA在脓毒症期间肠道上皮凋亡中的机制。结果：在肠穿孔引起的腹部脓毒症后，circFLNA在肠道上皮中上调。抑制miR-766-3p削弱了si-circFLNA介导的脂多糖处理的HIEC-6细胞中凋亡和炎症因子水平的抑制。circFLNA通过Fas介导的凋亡通路在LPS处理的HIEC-6细胞和小鼠盲肠结扎穿刺模型中加重了凋亡和炎症。结论：我们的发现表明circFLNA通过海绵吸附miR-766-3p经Fas介导的凋亡通路促进腹部脓毒症中的肠道损伤。circFLNA/miR-766-3p/Fas轴有望成为治疗脓毒症肠道损伤的新治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circRNA是否参与腹部脓毒症中肠道上皮细胞凋亡，以及circFLNA通过何种机制调控该过程？
- 核心机制
- circFLNA作为miR-766-3p的海绵，上调Fas表达，进而激活Fas介导的凋亡通路（包括FADD、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3），促进肠道上皮细胞凋亡和炎症。
- 主要证据
- 在LPS处理的HIEC-6细胞中，circFLNA敲低抑制凋亡和炎症，而miR-766-3p抑制剂逆转此效应；双荧光素酶报告实验和RIP实验证实circFLNA与miR-766-3p直接结合，Fas是miR-766-3p的直接靶点；小鼠CLP模型中，si-circFLNA减轻肠道损伤、炎症和凋亡，而miR-766-3p抑制剂削弱该保护作用。
- 研究意义
- circFLNA/miR-766-3p/Fas轴有望成为治疗脓毒症肠道损伤的新型治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circFLNA在临床样本和细胞模型中的表达验证
验证circFLNA在脓毒症肠道上皮中的表达变化
通过qRT-PCR检测20例脓毒症患者和23例非脓毒症患者肠道黏膜中circFLNA的表达；在LPS处理的HIEC-6细胞中检测circFLNA表达。
circFLNA的稳定性与亚细胞定位
确定circFLNA环状结构稳定性及细胞内定位
使用放线菌素D和RNase R处理检测circFLNA稳定性；通过核质分离和RNA-FISH检测circFLNA亚细胞定位。
circFLNA功能获得与丧失实验
评估circFLNA对细胞活力、凋亡和炎症的影响
在LPS处理的HIEC-6细胞中敲低或过表达circFLNA，检测细胞活力（CCK-8）、凋亡（流式细胞术）和炎症因子水平（ELISA）。
筛选circFLNA调控的下游靶基因
识别circFLNA调控的参与凋亡和炎症的关键蛋白
对circFLNA过表达的LPS处理的HIEC-6细胞进行蛋白微阵列分析，筛选差异表达蛋白；并通过qRT-PCR和Western blot验证Fas等候选基因。
鉴定circFLNA作为miR-766-3p海绵
验证circFLNA是否直接结合miR-766-3p并调控其表达
利用circInteractome、circBank和TargetScan数据库预测miRNAs；通过qRT-PCR检测circFLNA改变对miRNA表达的影响；双荧光素酶报告实验和RIP实验验证直接结合。
验证miR-766-3p直接靶向Fas及功能
验证miR-766-3p通过靶向Fas发挥抗凋亡和抗炎作用
Western blot检测miR-766-3p对Fas蛋白表达的影响；双荧光素酶报告实验验证Fas 3'-UTR与miR-766-3p的结合；功能回补实验检测凋亡和炎症变化。
circFLNA/miR-766-3p/Fas轴机制验证
证实circFLNA通过海绵吸附miR-766-3p调控Fas介导凋亡通路
在LPS处理的HIEC-6细胞中共转染si-circFLNA和miR-766-3p inhibitor，检测Fas表达、凋亡相关蛋白（FADD、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3）及凋亡和炎症水平。
小鼠CLP模型体内验证
评估circFLNA沉默及miR-766-3p抑制对脓毒症肠道损伤的体内影响
建立小鼠CLP模型，注射si-circFLNA和/或miR-766-3p inhibitor，观察生存率、肠道组织病理（H&E）、肠道通透性（D-乳酸、DAO、FD-40）、炎症因子水平及凋亡（TUNEL）。
体内Fas通路蛋白验证
确证circFLNA在体内通过靶向miR-766-3p促进Fas介导凋亡
通过免疫组化检测肠道上皮Fas表达，TUNEL检测凋亡，Western blot检测Fas、FADD、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3及紧密连接蛋白occludin、ZO-1。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
分析circRNA表达谱
验证细胞功能变化
验证免疫效应
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞处理 | 脂多糖（来源于大肠杆菌O111:B4） | Sigma-Aldrich | -- |
| RNA提取 | RNAiso Plus试剂 | TaKaRa | -- |
| RNA稳定性实验 | 核糖核酸酶R | Abcam | -- |
| 核质分离 | 细胞质和细胞核RNA纯化试剂盒 | Norgen Biotek | -- |
| qRT-PCR | SYBR-Green PCR预混试剂盒 | Takara | -- |
| QuantStudio Dx实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| FISH | 荧光原位杂交试剂盒 | GenePharma | -- |
| DAPI染色液 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | TCS SP2 AOBS共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine RNAiMax转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒 | Dojindo | -- |
| Gen5酶标仪 | BioTek | -- | |
| 细胞凋亡检测 | BD FACSCalibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| ELISA | ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 蛋白微阵列 | 人细胞因子抗体芯片4000 | RayBio | -- |
| InnoScan 300微阵列扫描仪 | Innopsys | -- | |
| Western blot | 抗Fas抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
| 抗FADD抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗Caspase-8抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗Caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗occludin抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗ZO-1抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 双荧光素酶报告实验 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | -- | |
| GloMax荧光检测仪 | Promega | -- | |
| RNA免疫沉淀 | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 抗AGO2抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗兔IgG | Cell Signaling Technology | -- | |
| 肠道通透性检测 | D-乳酸检测试剂盒 | Megazyme | -- |
| 免疫组化 | 抗Fas抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
| 辣根过氧化物酶标记的二抗 | Gene Tech | -- | |
| Image-Pro Plus 7图像分析软件 | Media Cybernetics | -- | |
| TUNEL染色 | TUNEL检测试剂 | Elabscience | -- |
| 荧光显微镜 | Leica Microsystems | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本收集与LCM | 患者来源、诊断标准（Sepsis 3.0）、隐窝上皮细胞分离方法及样本量（4例脓毒症患者和4例非脓毒症患者） 阅读提示：Materials and methods: Patients intestinal tissues; Laser capture microdissection and CircRNA microarray analysis |
| circRNA微阵列分析 | RNase R消化、微阵列平台（BoHao Bio-tech）、差异表达阈值（FC>2，P<0.05） 阅读提示：Materials and methods: Laser capture microdissection and CircRNA microarray analysis; Results: Circular RNA expression profiles |
| 细胞培养与LPS处理 | HIEC-6细胞来源、DMEM培养基、10% FBS、37°C、5% CO2；LPS浓度（50 μg/mL）和处理时间（24小时） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and chemicals; Results: Circular RNA expression profiles (Fig.1E,F) |
| circFLNA敲低和过表达 | si-circFLNA#1序列及其转染浓度（50 nM）、circFLNA过表达慢病毒、转染试剂（Lipofectamine RNAiMax） 阅读提示：Materials and methods: Plasmid construction and transfection; Results: circFLNA inhibits cell viability... |
| miR-766-3p mimics/inhibitor处理 | miR-766-3p mimics和inhibitor的转染浓度（50 nM）、共转染方案 阅读提示：Materials and methods: Plasmid construction and transfection; Results: circFLNA promotes apoptosis... (Fig.7) |
| 双荧光素酶报告实验 | WT/MUT circFLNA或Fas 3'-UTR载体构建、转染浓度、检测时间（48小时） 阅读提示：Materials and methods: Dual-luciferase reporter assay; Results: Fig.5F, Fig.6C |
| RIP实验 | AGO2抗体、裂解液、磁珠孵育条件、qRT-PCR检测circFLNA和miR-766-3p 阅读提示：Materials and methods: RNA immunoprecipitation; Results: Fig.5G,H |
| 小鼠CLP模型 | 小鼠品系（C57BL/6N）、周龄、体重、麻醉剂量、盲肠结扎位置、针头规格、造模后液体复苏 阅读提示：Materials and methods: Animals and cecal ligation and puncture (CLP) model |
| 小鼠分组与注射方案 | 分组信息、siRNA和inhibitor剂量（10 μg）、注射途径（尾静脉）、注射时间（CLP前24小时） 阅读提示：Materials and methods: Animal grouping and specimen collection |
| 肠道通透性检测 | D-乳酸、DAO ELISA检测；FD-40给药剂量（750 mg/kg）及灌胃时间（术后18小时）、采血时间（术后24小时） 阅读提示：Materials and methods: Detection of intestinal mucosal permeability |
| 组织学检测 | 组织固定、切片厚度、染色方法、Chiu's评分标准 阅读提示：Materials and methods: Hematoxylin and eosin staining, immunohistochemistry, and TUNEL staining |