Baculoviral COVID-19 Delta DNA vaccine cross-protects against SARS-CoV2 variants in K18-ACE2 transgenic mice.
该研究包含体外蛋白表达检测、体内免疫原性评估、同源和异源攻毒保护实验、组织病理学、病毒载量检测及细胞免疫评估等多个独立证据层级，并进行功能与机制验证。
K18-hACE2 转基因小鼠 C57BL/6 小鼠 Vero E6 细胞 Sf9 细胞
疫苗剂量：4 × 10^7 FFU/只（AcHERV 疫苗） 免疫方案：间隔 4 周两次肌肉注射 攻毒剂量：1 × 10^4 TCID50/只（原型、Delta、Omicron） 攻毒途径：鼻内途径 对照组：未处理对照组（NTC）
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建表达 SARS-CoV2 原型和 Delta 刺突蛋白的重组杆状病毒疫苗，并验证蛋白表达。
通过 PCR 扩增 Delta S 基因片段，将 K986 和 V987 替换为脯氨酸，并将 S1/S2 切割位点突变（RRAR 至 RRAN），构建 AcHERV-COVID19D。用 Bac-to-Bac 系统产生重组杆状病毒，感染 Vero E6 细胞后通过免疫荧光和 Western blot 检测 S 蛋白表达。
评估疫苗诱导的体液和细胞免疫反应。
小鼠免疫两次，间隔 4 周。ELISA 检测 S 蛋白特异性 IgG 抗体，中和实验检测中和抗体滴度，ELISPOT 检测脾细胞 IFN-γ 分泌，qRT-PCR 检测细胞因子表达。
评估 AcHERV-COVID19D 对 Delta 变异株的同源保护效果。
免疫 K18-ACE2 小鼠，攻毒 Delta 变异株，监测体重和存活率，14 天后取肺组织进行病毒载量检测和组织病理学分析。
评估 AcHERV-COVID19D 对原型和 Omicron 变异株的交叉保护能力。
将小鼠分组，分别用 AcHERV-COVID19D 和腺病毒载体疫苗免疫，然后分别用原型、Delta 和 Omicron 变异株攻毒，监测存活率、体重、病毒载量和组织病理学。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Sf-900II 培养基 | Invitrogen | -- |
| DMEM 培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Invitrogen | -- | |
| 病毒扩增 | Vero E6 细胞 | ATCC | -- |
| 病毒构建 | pFastBac-HERV 载体 | -- | -- |
| Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统 | Invitrogen | -- | |
| ELISA | 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体 | Abcam | -- |
| 山羊抗小鼠 IgG1 抗体 | Invitrogen | -- | |
| 山羊抗小鼠 IgG2a 抗体 | Invitrogen | -- | |
| TMB 底物溶液 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| Epoch 酶标仪 | BioTek Instruments | -- | |
| 免疫组化 | 兔抗 SARS 核衣壳蛋白抗体 | Novus | NB100-56576 |
| 山羊抗兔 IgG 辣根过氧化物酶抗体 | Abcam | -- | |
| DAB 底物 | Takara | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol 试剂 | Invitrogen | -- |
| SuperScript II 逆转录酶 | Invitrogen | -- | |
| SYBR Green 荧光染料 | -- | -- | |
| BacPAK qPCR 定量试剂盒 | Clontech | -- | |
| StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统 | Applied Biosystems | -- | |
| pGEM-T 载体 | -- | -- | |
| ELISPOT | AEC 底物试剂 | BD Biosciences | -- |
| ELISPOT 读板仪 | AID | -- | |
| RT-qPCR | Green Advantage qPCR 预混液 | Takara | -- |
| 统计 | GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 免疫接种 | 疫苗剂量（4×10^7 FFU/只）、免疫途径（肌肉注射）、免疫间隔（4周）、免疫次数（2次） 阅读提示：Methods 2.5 Immunization |
| 攻毒实验 | 攻毒剂量（1×10^4 TCID50/只）、攻毒途径（鼻内）、攻毒时间（末次免疫后3周）、观察时间（14天） 阅读提示：Methods 2.8 SARS-CoV2 challenge |
| 中和抗体检测 | 病毒用量（50 TCID50）、血清稀释系列、孵育时间（1小时）、细胞系（Vero E6）、孵育时间（3天） 阅读提示：Methods 2.7 SARS-CoV2 neutralization assay |
| ELISPOT 检测 | 刺激物（灭活 SARS-CoV2 株，7×10^5 TCID50/孔）、脾细胞来源、孵育时间（未明确说明） 阅读提示：Methods 2.12 IFN-γ ELISPOT assay |
| 组织病理学分析 | 组织固定（10% 福尔马林）、切片厚度（5 μm）、染色方法（H&E、IHC）、抗体（兔抗 SARS-N，NB100-56576） 阅读提示：Methods 2.9 H&E 染色和 2.10 IHC |
