血清kisspeptin水平主要取决于雌性大鼠卵巢中Kiss1 mRNA的表达

Serum kisspeptin levels mainly depend on ovarian expression of Kiss1 mRNA in female rats.

作者信息Ahreum Kwon, Ji Young Eom, Woo Jung Lee, Han Saem Choi, Kyungchul Song, Junghwan Suh, Hyun Wook Chae, Ho-Seong Kim
PMID36457308
发布时间2022-11-15
DOI10.3389/fphys.2022.998446

实验完整度

研究包含发育时序的血清与多器官基因/蛋白表达检测,并采用去卵巢及雌二醇替代模型进行功能验证,证据层级独立。

主要模型

雌性Sprague-Dawley大鼠 去卵巢大鼠模型 雌二醇处理的去卵巢大鼠

重点核对

大鼠发育阶段划分:新生(P4, P8)、幼年(P14)、青春前期(P23, P27)和阴道开口日 卵巢切除术在出生后第14天进行,样本采集在P23、P27和P34(或阴道开口日) 雌二醇剂量为25 μg/kg/天,皮下注射,从P14至阴道开口日 血清kisspeptin检测使用ELISA试剂盒(检测范围78.13–5000 pg/ml),样本稀释50倍 每组样本量为4至8只动物

摘要

下丘脑kisspeptin/KISS1受体系统对青春期启动和生殖发育至关重要。尽管血清kisspeptin可能与青春期有关,但其随发育阶段的变化水平及其来源仍不清楚。本研究评估了雌性大鼠青春期期间血清kisspeptin水平的变化以及各器官中相应的Kiss1 mRNA和蛋白表达,以确定血清kisspeptin的来源。获取包括卵巢和下丘脑前腹侧脑室周围核(AVPV)和弓状核(ARC)在内的多个器官组织,用于评估Kiss1 mRNA和蛋白表达。血清kisspeptin水平随发育阶段逐渐升高,直至青春前期。在所检查的器官中,卵巢显示出最高的Kiss1表达。接下来,我们探讨了去卵巢和雌二醇处理的去卵巢大鼠中血清kisspeptin水平及下丘脑Kiss1表达的变化。无论是否接受雌二醇处理,血清kisspeptin水平均下降;去卵巢和雌二醇处理增强了ARC中的Kiss1表达,而去卵巢降低了AVPV中的Kiss1表达,雌二醇则增强了其表达,提示血清kisspeptin可能与青春期发育相关,且主要依赖于卵巢Kiss1表达。因此,血清kisspeptin水平与青春期相关,并可能作为卵巢生殖功能的下游标志物。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
血清kisspeptin水平在青春期发育过程中的变化及其主要来源是什么?
核心机制
血清kisspeptin水平主要依赖于卵巢Kiss1表达,而非下丘脑AVPV和ARC的Kiss1表达;下丘脑kisspeptin通过激活HPG轴间接影响卵巢Kiss1表达。
主要证据
发育阶段卵巢Kiss1 mRNA和蛋白表达最高且与血清kisspeptin变化一致;去卵巢大鼠血清kisspeptin水平下降且不受雌二醇补充恢复,而下丘脑AVPV和ARC的Kiss1表达变化模式与血清水平不一致。
研究意义
血清kisspeptin水平可作为青春期卵巢生殖功能的下游标志物,但需进一步验证。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

发育阶段血清kisspeptin水平检测

评估雌性大鼠从新生至青春期不同发育阶段的血清kisspeptin变化模式。

在不同发育阶段(P4, P8, P14, P23, P27, 阴道开口日)采集血清样本,使用ELISA试剂盒测定kisspeptin浓度。

2

多器官Kiss1 mRNA和蛋白表达分析

确定不同发育阶段各器官中Kiss1表达水平,以识别血清kisspeptin的潜在来源。

从下丘脑(AVPV、ARC)、垂体、卵巢、子宫、肾上腺和胰腺组织中提取RNA和蛋白,分别通过RT-qPCR和Western blot检测Kiss1 mRNA和蛋白表达。

3

去卵巢和雌二醇替代模型中血清kisspeptin及下丘脑Kiss1表达检测

验证卵巢和下丘脑对血清kisspeptin水平的相对贡献,并区分卵巢与雌二醇的作用。

在P14行卵巢切除术,分别给予或不给予雌二醇(25 μg/kg/天皮下注射),在P23、P27和P34(或阴道开口日)采集血清和下丘脑组织,检测血清kisspeptin水平及AVPV和ARC中Kiss1 mRNA/蛋白表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
酶联免疫吸附测定试剂盒Elabscience BiotechE-EL-R2530
Trizol试剂Invitrogen--
LaboPass cDNA合成试剂盒Cosmo Gentech--
RIPA裂解缓冲液ATTOWSE-7420
kisspeptin抗体GeneTexGTX130503
β-肌动蛋白抗体Cell Signaling Technology#4970
BCA蛋白定量试剂盒Applygen Technologies Inc.--
TaqMan通用PCR预混液Applied Biosystems--
StepOnePlus实时荧光定量PCR仪Applied Biosystems--
Takara PCR试剂Takara--
雌二醇 (E-8875)Sigma Chemical Co.--
水解探针Applied BiosystemsKiss1: Rn00710914_m1, β-actin: Rn00667869_m1
山羊抗兔二抗----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物饲养与发育阶段判定
大鼠品系(Sprague-Dawley)、饲养条件(12:12光照、22°C)、阴道开口(VO)判定标准
阅读提示:Materials and Methods 2.1节
血清kisspeptin水平检测
ELISA试剂盒货源(Elabscience Biotech)及检测范围(78.13–5000 pg/ml)、血清稀释倍数(50倍)
阅读提示:Materials and Methods 2.2节
Kiss1 mRNA表达检测
RT-qPCR探针(Kiss1: Rn00710914_m1, β-actin: Rn00667869_m1)、参考基因(β-actin)、相对定量方法(2−ΔΔCt)
阅读提示:Materials and Methods 2.3节和2.4节
Kiss1蛋白表达检测
组织裂解缓冲液(WSE-7420, ATTO)、抗体(kisspeptin GTX130503, GeneTex;β-actin#4970, Cell Signaling)及稀释比例(1:500和1:3000)
阅读提示:Materials and Methods 2.5节
去卵巢及雌二醇替代模型
卵巢切除术时间(P14)、雌激素剂量(25 μg/kg/天,皮下注射)、样本采集时间点(P23, P27, P34或VO)
阅读提示:Materials and Methods 2.1节