重组蛋白LolA的克隆、表达和纯化
获得具有免疫原性的重组蛋白LolA。
从G. parasuis CY1201株扩增lolA基因，克隆至pET-28a载体，转化E. coli BL21(DE3)，IPTG诱导表达，His-Ni柱纯化，用SDS-PAGE和Western blot鉴定。
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小鼠中重组蛋白LolA疫苗对副猪格拉瑟菌血清13型感染的免疫原性与保护效果
Immunogenicity and protection against Glaesserella parasuis serotype 13 infection after vaccination with recombinant protein LolA in mice.
实验完整度
高包含重组蛋白表达纯化、小鼠免疫、抗体和细胞因子检测、致死攻击保护实验及病理和细菌载量分析，涉及体外表达和体内功能验证。
主要模型
小鼠模型（雌性昆明小鼠） 副猪格拉瑟菌CY1201株（血清13型） 大肠杆菌BL21(DE3)表达系统
重点核对
免疫剂量：100 μg重组蛋白，使用完全弗氏佐剂初次免疫，第14天用不完全弗氏佐剂加强免疫 攻击剂量：5 LD50（4.3 × 10^9 CFU）副猪格拉瑟菌CY1201株腹腔注射 抗体检测：间接ELISA检测IgG水平和滴度，血清稀释1:400 细胞因子检测：ELISA试剂盒检测IL-4、IL-10和IFN-γ水平 细菌载量测定：攻击后死亡小鼠和存活小鼠肝脏菌落计数
摘要
副猪格拉瑟菌是一种引起格拉瑟病的病原体，其特征是纤维蛋白性多发性浆膜炎、多关节炎和脑膜炎。由于商业疫苗中不同细菌抗原的交叉免疫原性较低，寻找和鉴定有效的免疫保护抗原将有助于开发新型亚单位疫苗。本研究通过生物信息学方法鉴定出LolA，将其克隆并成功在大肠杆菌中表达为重组蛋白，并在小鼠模型中评估了其免疫原性和保护效果。结果表明，重组蛋白LolA能刺激小鼠产生高水平的IgG抗体，并对高毒力副猪格拉瑟菌CY1201株（血清13型）的攻击提供50%的保护。通过检测白细胞介素4（IL-4）、IL-10和干扰素-γ（IFN-γ）的细胞因子水平，发现重组蛋白LolA能诱导小鼠产生Th1和Th2免疫应答。这些结果表明，重组蛋白LolA有潜力作为新型疫苗的替代抗原，以预防副猪格拉瑟菌感染。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 评估重组蛋白LolA在鼠模型中诱导免疫应答并保护免受高毒力副猪格拉瑟菌血清13型感染的能力。
- 核心机制
- LolA是外膜脂蛋白载体蛋白前体，参与脂蛋白从内膜到外膜的转运，作为抗原可诱导Th1和Th2型免疫应答，产生特异性IgG抗体。
- 主要证据
- 重组蛋白LolA免疫小鼠后，间接ELISA检测高水平IgG抗体，细胞因子检测显示IFN-γ、IL-4和IL-10水平显著升高，攻击试验提供50%保护，并减少肝脏细菌载量和病理损伤。
- 研究意义
- 重组蛋白LolA可作为新型亚单位疫苗的候选抗原，用于预防副猪格拉瑟菌感染，并需在仔猪中进一步评估免疫保护效果。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠免疫与攻击保护实验
评估重组蛋白LolA的免疫原性和保护效果。
65只雌性昆明小鼠随机分为5组（免疫组、灭活疫苗组、阴性对照、阳性攻击、空白对照），皮下注射重组蛋白乳化佐剂，二次免疫后攻击，记录存活率、临床症状和病理变化。
抗体和细胞因子检测
评估重组蛋白LolA诱导的体液和细胞免疫应答。
通过间接ELISA检测免疫小鼠血清IgG水平和滴度，并用ELISA试剂盒检测IL-4、IL-10和IFN-γ水平。
细菌载量测定
评估免疫对肝脏中副猪格拉瑟菌清除的影响。
攻击后死鼠和一周后存活小鼠肝脏无菌取样，研磨稀释后涂板计数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | 胰蛋白胨大豆肉汤 | Solarbio | -- |
| 胰蛋白胨大豆琼脂 | Solarbio | -- | |
| 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 | Solarbio | -- | |
| 细胞培养 | LB培养基 | Solarbio | -- |
| 基因扩增 | 细菌基因组DNA提取试剂盒 | TaKaRa | -- |
| 蛋白表达 | 异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷 | Sangon Biotech | -- |
| 蛋白纯化 | 镍柱树脂 | Cwbiotech | -- |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | Solarbio | -- |
| ECL发光液 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | TransGen Biotech | -- | |
| ELISA | 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | TransGen Biotech | -- |
| 酶标仪 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞因子检测 | ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| 超声破碎 | 超声波细胞粉碎机 | Zhisun Equipment | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组蛋白表达与纯化 | 诱导条件：OD600 0.5-0.6时加入1 mM IPTG，30°C诱导4小时；纯化：His-Ni柱，500 mM咪唑洗脱 阅读提示：Materials and Methods, Expression, purification, and identification of recombinant protein LolA |
| 动物免疫 | 小鼠品系和体重（雌性昆明小鼠18-22g）、免疫剂量（100 μg）、佐剂（完全/不完全弗氏佐剂）、免疫程序（第0天和14天） 阅读提示：Materials and Methods, Animal immunization and challenge experiments |
| 攻击实验 | 攻击菌株（CY1201，血清13型）、攻击剂量（5 LD50，4.3×10^9 CFU）、途径（腹腔注射）、监测时间（1周） 阅读提示：Materials and Methods, Animal immunization and challenge experiments; Results, Protective efficacy against G. parasuis challenge |
| 抗体检测 | 包被抗原量（200 ng/孔）、血清稀释度（1:400）、二抗稀释度（1:3000） 阅读提示：Materials and Methods, Determination of specific antibody IgG levels; Figure 2 legend |
| 细胞因子检测 | 检测细胞因子（IL-4, IL-10, IFN-γ）、检测时点（二免后14天）、试剂盒品牌（Elabscience） 阅读提示：Materials and Methods, Determination of cytokines by ELISA; Figure 3 legend |