建立ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫细胞模型
验证ox-LDL能否诱导THP-1衍生巨噬细胞形成泡沫细胞并改变TRIM64表达
用50 μg/mL ox-LDL处理THP-1衍生巨噬细胞48小时，通过油红O染色和胆固醇测定检测脂质积累，通过qRT-PCR和Western blot检测TRIM64表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
TRIM64 通过 IκBα 泛素化激活 NF-κB 反馈环路，促进 ox-LDL 诱导的 THP-1 衍生巨噬细胞泡沫细胞形成、焦亡和炎症
TRIM64 promotes ox-LDL-induced foam cell formation, pyroptosis, and inflammation in THP-1-derived macrophages by activating a feedback loop with NF-κB via IκBα ubiquitination.
实验完整度
高包含体外细胞实验（THP-1巨噬细胞）、体内动物实验（ApoE-/-小鼠），并进行了分子机制验证（Co-IP、泛素化、ChIP等）和功能获得/缺失实验。
主要模型
THP-1衍生巨噬细胞 ApoE-/-小鼠高脂饮食诱导动脉粥样硬化模型
重点核对
ox-LDL浓度50 μg/mL处理48小时 NF-κB抑制剂PDTC（10 μM）或体内剂量100 mg/kg腹腔注射 IκBα的K67位点突变体（K67R） TRIM64 shRNA序列（shTRIM64-1, -2, -3）
摘要
动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，是大多数心血管疾病的主要病理基础，巨噬细胞的过度活化启动了动脉粥样硬化的发展。然而，氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）在巨噬细胞中的具体功能仍不清楚。单核细胞（THP-1）来源的巨噬细胞用ox-LDL处理，并用于建立动脉粥样硬化体外模型。使用定量RT-PCR和Western blot检测NLRP3炎症小体标志物。使用ELISA检测细胞因子。利用染色质免疫沉淀（ChIP）检测核因子kappa B（NF-κB）与TRIM64的相互作用。体内研究采用高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠。ox-LDL以时间依赖性方式促进TRIM64表达。根据功能缺失和功能获得分析，TRIM64增强了NLRP3炎症小体的激活及下游分子的表达。TRIM64与IκBα直接相互作用，并促进IκBα在K67位点的泛素化，从而激活NF-κB信号通路。我们检测到NF-κB与TRIM64启动子直接结合，以及TRIM64表达增强。我们的研究揭示了TRIM64与NF-κB在动脉粥样硬化发展中的相互作用。TRIM64和NF-κB形成正反馈回路，激活NF-κB通路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TRIM64在ox-LDL诱导的巨噬细胞泡沫细胞形成、焦亡和炎症中的作用及其机制。
- 核心机制
- TRIM64通过促进IκBα在K67位点的泛素化降解，激活NF-κB信号通路，并与NF-κB形成正反馈环路，增强NLRP3炎症小体激活和炎症反应。
- 主要证据
- 体外实验显示，TRIM64敲低抑制ox-LDL诱导的泡沫细胞形成、焦亡和炎症，过表达则增强这些效应；Co-IP和泛素化实验证明TRIM64与IκBα互作并促进其K67泛素化；ChIP和荧光素酶报告基因实验显示NF-κB直接结合TRIM64启动子并受PDTC抑制；体内实验显示PDTC抑制HFD诱导的动脉粥样硬化病变和炎症。
- 研究意义
- 研究揭示了TRIM64与NF-κB的反馈调控在动脉粥样硬化中的作用，提示TRIM64可能成为未来动脉粥样硬化治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TRIM64功能缺失和获得实验
确定TRIM64对ox-LDL诱导的泡沫细胞形成、焦亡和炎症的影响
用shRNA敲低TRIM64或过表达载体过表达TRIM64，用ox-LDL处理，检测脂质积累（油红O染色、胆固醇测定），Western blot检测CD36、ABCA1、NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-N，流式检测焦亡，ELISA检测炎症因子。
验证NF-κB信号通路参与TRIM64功能
确定TRIM64的功能是否通过NF-κB信号通路介导
用NF-κB抑制剂PDTC处理TRIM64过表达的细胞，检测脂质积累、焦亡、炎症因子和NF-κB激活。
探索TRIM64与IκBα的相互作用及泛素化机制
揭示TRIM64如何激活NF-κB信号通路
通过免疫沉淀（Co-IP）、质谱分析、泛素化实验、定点突变（K22R, K38R, K67R）和pull-down实验，确定TRIM64与IκBα的相互作用及泛素化位点。
验证NF-κB与TRIM64启动子结合及正反馈
确定NF-κB是否结合TRIM64启动子并受PDTC抑制
使用荧光素酶报告基因检测PDTC对TRIM64启动子活性的影响，ChIP实验检测NF-κBp65与TRIM64启动子的结合，qRT-PCR和Western blot检测PDTC对TRIM64表达的影响。
体内实验验证NF-κB抑制对动脉粥样硬化的影响
验证NF-κB抑制是否能在体内减轻动脉粥样硬化
对HFD诱导的ApoE-/-小鼠腹腔注射PDTC（100 mg/kg/天，持续8周），检测主动脉病变、血脂、脂质代谢相关蛋白（CD36, ABCA1）、炎症因子和NF-κB活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素G | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 氧化型低密度脂蛋白 | Yiyuan Biotech | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 油红O染色 | 油红O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | -- |
| 胆固醇测定 | 游离胆固醇测定试剂盒 | Solarbio | -- |
| 总胆固醇测定试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co. Ltd | -- | |
| 细胞死亡检测 | Caspase-1 p20抗体/FITC | Eterlife Ltd. | -- |
| 碘化丙啶 | Thermofisher | -- | |
| Accuri C6流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| ELISA | 人TNF-α ELISA试剂盒 | Abcam | ab181421 |
| 人IL-6 ELISA试剂盒 | Abcam | ab178013 | |
| IL-18 ELISA试剂盒 | Sigma-Aldrich | RAB0543 | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Sigma-Aldrich | RAB0273 | |
| 双荧光素酶报告基因实验 | Lipofectamine 2000转染试剂 | -- | -- |
| pGL3-basic质粒 | -- | -- | |
| pRL-TK质粒 | -- | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | -- | |
| 染色质免疫沉淀 | 甲醛 | -- | -- |
| Bioruptor超声破碎仪 | Diagenode | -- | |
| IgG抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| NF-κBp65抗体 | Abcam | ab16502 | |
| 细胞转染 | pLVX-Puro慢病毒表达载体 | Clontech Laboratories, Inc. | -- |
| pLKO.1慢病毒载体 | Addgen | -- | |
| pMD2G质粒 | -- | -- | |
| psPAX2质粒 | -- | -- | |
| pCMV-Tag 2B载体 | -- | -- | |
| QuikChange定点突变试剂盒 | Stratagene | -- | |
| p-DONR221载体 | GENEWIZ | -- | |
| pcDNA-DEST40载体 | -- | -- | |
| RNA提取和RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript III反转录PCR试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| ABI 9700实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| SYBR green PCR预混液 | -- | -- | |
| 蛋白提取和Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | -- | |
| BCA蛋白定量试剂 | Thermo Scientific | -- | |
| NE-PER核质分离试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| SDS-PAGE凝胶 | Millipore | -- | |
| Western blot抗体 | TRIM64抗体 | Novus Biologicals | NBP2-83,713 |
| CD36抗体 | Abcam | ab133625 | |
| ABCA1抗体 | Abcam | ab18180 | |
| NF-κB抗体 | Abcam | ab16502 | |
| NLRP3抗体 | Abcam | ab232401 | |
| ASC抗体 | Abcam | ab155970 | |
| caspase-1抗体 | Abcam | ab207802 | |
| GSDMD-N抗体 | Abcam | ab215203 | |
| IκBα抗体 | Abcam | ab32518 | |
| H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4499 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| Western blot检测 | 增强化学发光检测试剂盒 | Servicebio | -- |
| 免疫沉淀和质谱 | pCMV-Flag载体 | -- | -- |
| anti-Flag磁珠 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Flag多肽 | -- | -- | |
| 质谱仪（Thermo Scientific Q Exactive） | Thermo Scientific | Q | |
| 免疫共沉淀和泛素化 | TRIM64抗体 | Biorbyt LLC. | orb455353 |
| IgG抗体 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-2027 | |
| 蛋白A/G磁珠 | New England BioLabs | -- | |
| Pull-down实验 | Ni2+-NTA琼脂糖珠 | Qiagen | -- |
| 动物实验 | 高脂饮食 | -- | -- |
| PDTC | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| THP-1巨噬细胞培养和处理 | PMA浓度5 ng/mL，处理24小时；ox-LDL浓度50 μg/mL，处理48小时。 阅读提示：详见Materials and methods中的“Cell culture and treatment” |
| 泡沫细胞形成检测 | Oil Red O染色，细胞阳性判定标准（≥5个颗粒），TC、FC、CE/TC测定。 阅读提示：详见Materials and methods中的“Oil Red O staining”和“Cellular cholesterol assay” |
| TRIM64敲低和过表达 | shRNA序列和过表达载体，转染方法（Lipofectamine 2000）。 阅读提示：详见Materials and methods中的“Cell transfection” |
| NF-κB抑制实验 | PDTC浓度10 μM（体外），体内剂量100 mg/kg腹腔注射，每日一次，持续8周。 阅读提示：详见Materials and methods中的“Cell culture and treatment”和“In vivo experiments” |
| 动物实验 | ApoE-/-小鼠周龄（8周），高脂饮食配方（1%胆固醇，0.25%胆酸），持续12周，PDTC处理8周。 阅读提示：详见Materials and methods中的“In vivo experiments” |