谱系追踪确定Tbx1表达细胞
确定Tbx1在脑发育中的表达细胞类型及分布模式
使用Tbx1Cre/+;RosamTmG小鼠进行谱系追踪，通过免疫染色检测GFP标记的Tbx1表达细胞与内皮细胞标志物KDR或GLUT1的共定位。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
VEGFR3调节22q11.2缺失综合征小鼠模型中的脑微血管分支
VEGFR3 modulates brain microvessel branching in a mouse model of 22q11.2 deletion syndrome.
实验完整度
高包含基因表达谱系追踪、遗传互作实验、体外Matrigel实验和转基因过表达拯救实验，多层次功能验证。
主要模型
小鼠胚胎脑 HUVEC细胞 bEND5细胞
重点核对
Tbx1Cre/+;Vegfr3flox/+胚胎的脑切片分支点和丝状伪足密度 Vegfr3+/−胚胎的脑切片分支点和丝状伪足密度 HUVEC中转染siRNA-TBX1和pcDNA3-Vegfr3后的微管分支 TgVegfr3;Tbx1Cre/+和TgVegfr3;Tbx1Cre/lacZ胚胎的脑血管密度 Tbx1Cre/+;RosamTmG胚胎中Tbx1谱系细胞分布
摘要
本研究提供了遗传学证据，表明VEGFR3调节胚胎小鼠大脑中的血管分支和丝状伪足形成，并且可能是Tbx1突变小鼠脑血管异常的中介因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TBX1在脑微血管分支中的功能是否通过VEGFR3介导？
- 核心机制
- TBX1通过上调Vegfr3表达来抑制血管分支，VEGFR3是TBX1调节脑微血管分支的关键介导因子。
- 主要证据
- 在Tbx1突变背景下，Vegfr3缺失加重血管分支和丝状伪足形成；过表达Vegfr3完全拯救该表型；体外HUVEC实验中Vegfr3过表达抑制微管分支。
- 研究意义
- 确定VEGFR3是TBX1在脑微血管中的关键靶点，为理解22q11.2缺失综合征的脑血管异常提供了机制基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测VEGFR3与TBX1在脑内皮细胞中的共表达
寻找TBX1-VEGFR3相互作用的潜在位点
对Tbx1Cre/+;RosamTmG胚胎的脑切片进行GFP和VEGFR3共染色，分析共定位情况，特别关注尖端细胞。
遗传互作实验
检验Vegfr3杂合缺失对Tbx1突变表型的影响
将Tbx1Cre/+和Vegfr3flox/+小鼠杂交，在E18.5胚胎脑切片中定量分支点密度和丝状伪足密度。
体外内皮细胞管形成实验
评估Vegfr3表达变化对内皮细胞微管分支的影响
在HUVECs中敲低或过表达Vegfr3，并在Matrigel中培养，定量微管分支点。
转基因拯救实验
验证Tbx1驱动Vegfr3过表达是否挽救Tbx1突变体的脑血管异常
将Tbx1Cre/+与TgVegfr3小鼠杂交，在E18.5胚胎脑切片中定量血管密度和丝状伪足密度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫荧光 | 抗GLUT1抗体 | Abcam | ab40084 |
| 抗GFP抗体 | Abcam | ab13970 | |
| 抗VEGFR3/FLT4抗体 | eBioscience | 14-5988-85 | |
| 抗VEGFR3/FLT4抗体 | Elabscience | 36398 | |
| 抗VEGFR2/KDR抗体 | BD Pharmingen | 550549 | |
| 细胞培养 | 人脐静脉内皮细胞 | Lonza | -- |
| bEND5细胞 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA干扰 | ON-TARGETplus SMARTpool siRNA | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 过表达 | pcDNA3-Vegfr3质粒 | GeneCopoeia | -- |
| pcDNA3-TBX1质粒 | -- | -- | |
| Matrigel分析 | Matrigel基质胶 | BD Bioscience | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | GIBCO | -- |
| 胎牛血清 | GIBCO | -- | |
| 显微镜 | Leica DMI6000B显微镜 | Leica | -- |
| 尼康共聚焦显微镜A1 | Nikon | -- | |
| Leica Thunder成像系统 | Leica Microsystems | -- | |
| Olympus CKX41图像分析仪 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 谱系追踪 | Tbx1Cre/+;RosamTmG胚胎的阶段（E9.5-E18.5）、脑切片方向（冠状）、免疫染色抗体（抗KDR或抗GLUT1）及共定位分析。 阅读提示：Methods: Immunofluorescence on brain sections; Figure 1 and 2 legends |
| 遗传互作 | Tbx1Cre/+;Vegfr3flox/+和Vegfr3+/−胚胎的脑切片分支点和丝状伪足密度。 阅读提示：Methods: Quantitative analysis of vascular anomalies; Figure 4 legend |
| 体外实验 | HUVECs的转染条件（siRNA浓度、质粒用量）、Matrigel培养时间和分支点定量方法。 阅读提示：Methods: Cell manipulations, Matrigel assays; Figure 5 legend |
| 转基因拯救 | TgVegfr3;Tbx1Cre/+和TgVegfr3;Tbx1Cre/lacZ胚胎的脑切片血管密度和丝状伪足密度。 阅读提示：Methods: Quantitative analysis of vascular anomalies; Figure 6 legend |
| qRT-PCR | Vegfr3基因表达水平，内参基因（PECAM1和GAPDH）的选择。 阅读提示：Figure S5 legend; Methods: Cell manipulations |